Введение. В последние годы во многих странах мира, в том числе в ряде регионов России, отмечают рост заболеваемости, связанный с нарушением иммунорегуляторных процессов в организме, которые в свою очередь приводят к росту инфекционных, аллергических, аутоиммунных, лимфопролиферативных и злокачественных заболеваний [1]. При этом одними из опасных загрязнителей объектов окружающей среды считают пестицидные препараты [3, 4, 5]. Тем не менее в системе интегрированной защиты растений и животных применение пестицидов остается единственно эффективным и экономичным способом предотвращения эпифитотий и массового размножения вредных организмов, что позволяет предотвратить значительные потери урожая сельскохозяйственных культур, а также профилактировать заболевания, передающиеся эктопаразитами животных. Необходимость преодоления резистентности, экономические и экологические причины способствовали созданию в конце 90-х годов препаратов с «иным» механизмом действия и малыми нормами расхода. Именно этими характеристиками обладают неоникотиноиды – инсектициды и фунгициды, производные 6-хлорникотиниловой кислоты [5, 6, 7].
В настоящее время на ветеринарном фармацевтическом рынке активно позиционируются инсектоакарицидные препараты Адвокат® (10% имидаклоприд +2,5% моксидектин, Байер КропСайенс АГ, Германия) и Инспектор Тотал К® (10% фипронил + 1% моксидектин, разработанный НПФ «Экопром» под контролем лаборатории Veterinary Bio UG (Германия)) – комбинированные противопаразитарные средства широкого спектра действия, активные в отношении паразитирующих у собак демодекозных (Demodex canis) и саркоптоидных (Sarcoptes canis, Otodectes cynotis) клещей, блох (Stenocephalides canis), вшей (Linognatus setotus), власоедов (Trichodectes canis), личиночных и половозрелых фаз развития кишечных нематод, включая Toxocara canis, Toxascaris leonina, Ancylostoma caninum, Ancylostoma tubaeforme, Uncinaria stenocephala, Trichuris vulpis, и личиночных форм Dirofilaria immitis.
Имидаклоприд, действующее вещество Адвоката®, относится к группе хлорникотиниловых инсектицидов (неоникотиноидов), механизм действия которых основан на взаимодействии с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами членистоногих и нарушении передачи нервных импульсов, что приводит к их гибели. Фипронил – действующее вещество Инспектора Тотал К®, относится к группе фенилпиразольных соединений, механизм действия которых основан на торможении прохождения ионов хлора в ГАМК-зависимых хлоридных каналах членистоногих и нарушении передачи нервных импульсов, что также является причиной их гибели.
Моксидектин является полусинтетическим соединением из группы милбемицинов и входит в состав обоих препаратов. Оказывая стимулирующее действие на выделение гамма-аминомасляной кислоты и связываясь с постсинаптическими рецепторами, моксидектин вызывает нарушение мышечной иннервации, паралич и гибель эктопаразитов и нематод. Включение в состав моксидектина расширяет спектр противопаразитарного действия препаратов.
По степени воздействия на организм Адвокат® и Инспектор Тотал К® относят к умеренно опасным веществам. В рекомендуемых дозах препараты не оказывают местно-раздражающего, эмбриотоксического, тератогенного, мутагенного и иммунотоксического действия, хорошо «переносятся» животными.
Следует отметить, что в практической деятельности ветеринарные врачи нередко сталкиваются с отравлениями животных противопаразитарными лекарственными средствами, в том числе неоникотиноидами. Публикации зарубежных исследователей также свидетельствуют о существовании проблемы, связанной с применением неоникотиноидов в сельскохозяйственном производстве [8, 9, 10, 11, 12]. При этом изучение влияния неоникотиноидов на иммунную систему является актуальной и практически значимой задачей для ветеринарной медицины, так как позволяет прогнозировать отдаленные эффекты препаратов.
В организме животного и человека селезенке отводится важнейшая защитная функция, которая выражается в захвате и нейтрализации вредных веществ и образовании специфических иммунных тел. Принимая активное участие в формировании клеточного и гуморального иммунитета, изменения цитоморфологической картины в органе могут рассматриваться как критерий их иммунотоксического действия на организм животных.
Цель работы – дать сравнительную цитоморфологическую характеристику селезенки крыс при воздействии токсических доз комбинированных пестицидных препаратов Адвокат® и Инспектор Тотал К®.
Материалы и методы исследования. Эксперимент проводили на половозрелых нелинейных белых крысах самцах (n=15) с массой тела 230-250 г. Содержание, кормление и уход за животными, выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с рекомендациями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (2003).
Пестицидные препараты Адвокат® (1-ая опытная) и Инспектор Тотал К® (2-ая опытная) наносили на холку однократно в утренние часы в дозе 100 мг/кг однократно. Взятие материала для исследования проводили через четверо суток после нанесения препаратов. Контролем служили интактные животные, которым на область холки наносили физиологический раствор (группа сравнения, n=5).
Препараты-отпечатки селезенки готовили сразу после убоя животных. После высушивания их фиксировали этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому – Гимза в течение 40 минут.
Микрофотосъемку осуществляли на микроскопе Альтами БИО 1Т с цифровой окулярной камерой UCMOS0300KPA. Подсчет клеток осуществляли в 10 полях зрения микроскопа с вычислением процента каждого вида клеток. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета прикладных статистических программ STATISTICA 6.0. с использованием непараметрического критерия Mann-Whitney. Различия считали значимыми при р<0,05.
Результаты исследований. Селезенка крыс контрольной группы имела типичный цитологический состав (рис.1). При этом малые формы лимфоцитов преобладали над остальными клетками лейкоцитарного ряда. Эозинофилы и тучные клетки составляли не более 0,4%, плазматические – 3,5% (табл. №1).
Таблица №1– Клеточный состав селезенки крыс
|
Клетки |
|
Группы |
||
|
Контроль |
1-ая опытная группа |
2-ая опытная группа |
||
|
Малые лимфоциты |
Ме (Р25,Р75) |
436,0(427,0;449,0) |
143(139,0;145,0) |
275,0(275,0;279,0) |
|
Рm-u |
|
0,009 |
0,009 |
|
|
Средние лимфоциты |
Ме (Р25,Р75) |
103,0(99,0;104,0) |
552,0(446,0;559,0) |
346,0(344,0;347,0) |
|
Рm-u |
|
0,009 |
0,009 |
|
|
Большие лимфоциты |
Ме (Р25,Р75) |
74,8(70,0;78,0) |
65,8(63,0;68,0) |
32,6(30,0;35,0) |
|
Рm-u |
|
0,094 |
0,009 |
|
|
Нейтрофилы
|
Ме (Р25,Р75) |
191,6(189,0;193,0) |
25,4(22,0;29,0) |
27,2(26,0;28,0) |
|
Рm-u |
|
0,009 |
0,009 |
|
|
Эозинофилы
|
Ме (Р25,Р75) |
3,6(3,0;4,0) |
10,0(8,0;11,0) |
33,4(31,0;35,0) |
|
Рm-u |
|
0,009 |
0,009 |
|
|
Базофилы |
Ме (Р25,Р75) |
1,8(1,0;2,0) |
0,40(0,00;1,0) |
0,6(0,0;1,0) |
|
Рm-u |
|
0,028 |
0,047 |
|
|
Плазматические клетки |
Ме (Р25,Р75) |
35,4(32,0;36,0) |
68,4(68,0;69,0) |
95,6(92,0;99,0) |
|
Рm-u |
|
0,009 |
0,009 |
|
|
Ретикулярные клетки |
Ме (Р25,Р75) |
146,0(140,0;155,0) |
122,6(122,0;124,0) |
172,8(172,0;177,0) |
|
Рm-u |
|
0,009 |
0,009 |
|
|
Моноциты/ Макрофаги |
Ме (Р25,Р75) |
7,2(6,0;8,0) |
11,6(10,0;12,0) |
13,0(12,0;14,0) |
|
Рm-u |
|
0,012 |
0,009 |
|
Цитоморфология селезенки крыс опытной группы, обработанных препаратом Адвокат® (1-ая опытная группа), резко отличалась от контрольных значений (рис. 2). Было установлено достоверное повышение количества средних лимфоцитов с рыхлым ядерным хроматином (55%), на фоне увеличения плазматических клеток (6,8%), макрофагов – 1,2 % и эозинофилов – 1 %. Следует отметить достоверно низкое содержание малых форм лимфоцитов, которые составили 14%.
Рис. 1 – Цитоморфология селезенки интактных крыс.
Рис. 2 – Цитоморфология селезенки крыс 1-й опытной группы.
Рис. 3. – Цитоморфология селезенки крыс 2-ой опытной группы.
Морфологический состав селезенки опытной группы животных, обработанных Инспектор Тотал К® (2-ая опытная группа), характеризуется повышением количества эозинофилов на фоне достоверного снижения базофилов. Количество средних форм лимфоцитов было достоверно больше, чем в контроле, но ниже, чем в первой группе животных (рис. 3). Достоверно повышалось количество плазматических клеток и макрофагов, что составило 9,6 и 1,3% соответственно.
Согласно общей неспецифической адаптационной теории, в ответ на действие различных по качеству раздражителей, в том числе и пестицидов, развивается «реакция активации», характеризующаяся подъемом активности защитных и регуляторных подсистем организма, которая несет основную антистрессовую функцию. При продолжительном действии данных факторов (пестицидов) реакция повышенной активации легко переходит в реакцию переактивации, которая является неспецифической основой предпатологии и патологии [2], что следует учитывать ветеринарным специалистам при назначении пестицидных препаратов для комплексного лечения животных с иммунопатологией. Результаты наших исследований указывают на то, что оба препарата вызывают реакцию повышенной активации в ответ на применение инсектицидных препаратов в повышенных дозах, при этом Инспектор Тотал К® в большей степени изменяет цитологическую картину селезенки.
Выводы:
1. Однократное применение противопаразитарных препаратов Адвокат® и Инспектор Тотал К® в токсических дозах изменяет цитологическую картину препаратов-отпечатков селезенки, что свидетельствует о включении ее в реакции иммунного ответа, характер которых зависит от химического строения пестицида.
2. Препараты Адвокат® и Инспектор Тотал К® достоверно увеличивают в селезенке количество активированных лимфоцитов, плазматических клеток, макрофагов и эозинофилов на фоне достоверного снижения малых форм лимфоцитов, что характерно для развития реакции повышенной активации в организме в ответ на действие пестицидов.
3. Результаты исследований могут быть использованы в качестве критерия оценки иммунотоксического действия этих препаратов на организм животных и разработки рациональной фармакокоррекции этих состояний.
Рецензенты:
Герунова Л.К., д.вет.н., профессор, профессор кафедры диагностики, внутренних незаразных болезней, фармакологии, хирургии и акушерства Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина», г. Омск.
Конвай В.Д., д.м.н., профессор, профессор кафедры физики и химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина», г.Омск.