Введение

Коллаген I типа является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса и определяет механическую прочность сформированного рубца. Синтез коллагена I типа осуществляется многочисленными клетками, но в основном молодыми фибробластами с развитым синтетическим аппаратом. После повреждения дермы его экспрессия возрастает, так как фибробласты усиленно синтезируют внеклеточный матрикс. Этот процесс необходим для закрытия раневого дефекта, но его интенсивность и продолжительность должны быть строго ограничены. Так, недостаточное образование COL1 снижает прочность ткани и увеличивает риск травматизации. Длительная и усиленная активация синтеза способствует гипертрофическому рубцеванию и фиброзу [1; 2].

Согласно современным представлениям, среди фибробластов выделяют множество различных популяций [3]. Экспрессия COL1 вследствие этого отражает активность нескольких популяций фибробластов.

Секретом мезенхимных стромальных клеток влияет напрямую на пролиферацию и дифференцировку через факторы TGF-β-, PI3K/AKT- и Wnt-сигнальные пути, а косвенно - регулируя воспаление и ангиогенез [4; 5]. Изменение функциональной активности макрофагов ограничивает продолжительность провоспалительных стимулов, усиление неоангиогенеза обеспечивает грануляционную ткань кислородом, а паракринное воздействие на фибробласты модулирует их миграцию, пролиферацию и дифференцировку. Именно такая многосторонняя регуляция объясняет одновременное ускорение образования волокон и снижение проявлений фиброза на поздних стадиях репарации.

В доклинических работах получены признаки усиления коллагенообразования после применения кондиционированной среды. Секретомы дермальных и жировых мезенхимных клеток, хотя и различались по протеомному профилю, но приводили к усилению пролиферации клеток. При этом ускорение закрытия раны не было выявлено [6]. Экзосомы клеток пупочного канатика увеличивали экспрессию коллагена I и III типов и усиливали образование коллагена в ожоговой ране [7]. Экзосомы жировых клеток усиливали образование коллагена I и III типов, ангиогенез и активацию макрофагов [8]. Эти наблюдения подтверждают способность секретома воздействовать на матрикс. Так, выявлено, что экзосомы жировых мезенхимных клеток способны подавлять фиброз [9].

Согласно данным литературы, действие внеклеточных везикул с TGF-β/Smad- и PI3K/AKT-зависимой регуляцией связывают с изменением ангиогенеза, воспалительного ответа, функции кератиноцитов и фибробластов; выраженность эффекта зависит от происхождения клеток, условий культивирования и лекарственной формы [10]. Так, секретом мезенхимальных стволовых клеток приводил к увеличению числа Ki-67+ эпителиоцитов, усилению ангиогенеза, о чем свидетельствует усиление экспрессии CD31 [11]. Экзосомы мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани способны подавлять избыточный фиброз посредством активации сигнальной оси miR-128-1-5p. Так, осуществляется подавление TGF-β1 и снижение экспрессии Smad2/3 [9]. В экспериментальных моделях применение секретома и его экзосомальных компонентов сопровождалось увеличением образования коллагена I и III типов, повышением плотности коллагеновых волокон и ускорением заживления кожных ран [7; 12; 13].

Топические системы доставки создают особую возможность управлять временем контакта препарата с раневым ложем. Гидрогель с секретомом жировых мезенхимных клеток повышал плотность коллагена и ускорял заживление ожога [12]. В исследовании регенерации диабетических ран при использовании секретома мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика установлено усиление миграции и пролиферации фибробластов, что приводило к усилению ангиогенеза [13]. В другой модели секретом приводил к усилению пролиферации, экспрессии VEGF [14]. Инъекционное введение позволяет доставить секретом непосредственно в дерму, где расположены фибробласты, сосуды и неповреждённые участки матрикса. Влияние топического и инъекционного введения секретома стромальных клеток на коллагенпродуцирующие клетки исследовано недостаточно.

Цель исследования

Сравнить плотность расположения COL1A1-позитивных клеток дермы при инъекционном и топическом применении секретома мезенхимальных стромальных клеток с различной кратностью процедур в процессе репаративной регенерации кожи.

Материалы и методы исследования

Эксперимент проведён в виварии Южно-Уральского государственного медицинского университета на 88 самцах крыс Wistar в возрасте 3,5–5 мес. и массой 260–320г. 88 самцам Wistar моделировали механическое повреждение кожи. Сформированы восемь групп: I - интактный контроль (n = 4); II - повреждение кожи без терапии (n = 16); III и IV - повреждение и однократное инъекционное/топическое применение Re:Q (по n = 16); V и VI - повреждение и трёхкратное инъекционное/топическое применение (по n = 12); VII и VIII - повреждение и пятикратное инъекционное/топическое применение (по n = 8). На каждом доступном сроке исследовали по четыре животных соответствующей группы. В качестве исследуемого средства использовали коммерческий препарат Re:Q 50 (KBBIO Co., Ltd., Республика Корея) - бесклеточный продукт на основе кондиционированной среды мезенхимальных стромальных клеток (MSC-conditioned medium, MSC-CM), содержащий 50% кондиционированной среды МСК жировой ткани. Кондиционированная среда представляет собой культуральный супернатант с цитокинами, факторами роста, пептидами и компонентами внеклеточных везикул – экзосомами. Заявленная производителем чистота экзосом мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани составляет 98%, плотность расположения 40 млн частиц/мл, размер частиц 50-200нм. Инъекционное введение препарата осуществляли локально в периферическую зону раневого дефекта. Препарат вводили в шесть равноудалённых точек, расположенных по окружности раны. Объём одной инъекции составлял 20мкл, суммарный объём препарата, вводимого на одну рану за одну процедуру, - 120мкл. При топическом применении идентичный объем препарата был нанесен на раневую поверхность механически поврежденной кожи при помощи инсулинового шприца.

Модель посттравматической регенерации осуществлялась путем нанесения резаной травмы 92 самцам крыс под общим обезболиванием смесью тилетамина и золазепама (Золетил 100; VIRBAC, Франция) в дозе 50мг/кг в сочетании с 0,1% раствором атропина («Московский эндокринный завод», РФ) в дозе 0,5мг/кг. Дефект кожи диаметром 6мм формировали на спине на 1см ниже уровня лопаток с помощью устройства для панч-биопсии (Apexmed International B.V., Нидерланды). Препарат применяли однократно на 7-е сутки, трёхкратно на 7, 10 и 15-е сутки либо пятикратно на 7, 10, 15, 20 и 25-е сутки после моделирования повреждения. Животных выводили из эксперимента асфиксией углекислым газом.

Исследование одобрено этическим комитетом Южно-Уральского государственного медицинского университета (протокол №5 от 08.06.2026) и выполнено с соблюдением международных принципов гуманного обращения с экспериментальными животными в соответствии с решением Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 81, ГОСТ 33215-2014.

Фрагменты кожи фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине (pH 7,2) в течение 24ч, заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 3мкм. После стандартной гистологической проводки, приготовления парафиновых блоков и срезов проводилось иммуногистохимическое окрашивание препаратов. Срезы наносили на стёкла с поли-L-лизином. Демаскировку антигенов выполняли в цитратном буфере при 96–98 °C в течение 40 мин. Для иммуногистохимической реакции использовали антитела к COL1A1 (Cloud-Clone, КНР; MAA350Ra21) и систему детекции IHC Support Pack (Cloud-Clone, КНР). Препараты исследовали на микроскопе LEICA DMRXA с камерой LEICA DFC 290 (Leica, Германия) и программой ImageScope M (ООО «АТМ-практика», РФ). В дерме определяли плотность COL1A1-позитивных клеток в пересчёте на 1мм². Для морфометрических исследований использовали графические файлы в цветовом пространстве RGB в формате *.TIFF, созданные при увеличении 400 (об.×40; ок.×10) и 1000 (об.×100; ок.×10) с использованием масляной иммерсии.

Для каждого экспериментального животного анализировали пять неперекрывающихся полей зрения гистологического препарата. Отдельные поля зрения рассматривали как повторные измерения, вложенные в одно животное; независимой экспериментальной единицей являлось животное (n = 4 в каждой группе). Для каждого животного данные представляли в виде медианы и межквартильного диапазона - Me [Q1; Q3]. Межгрупповые различия оценивали с использованием обобщённых оценочных уравнений. Кластерная переменная – животное. Для оценки стандартных ошибок использовали робастную оценку ковариационной матрицы с маловыборочной коррекцией. Попарные сравнения между группами выполняли на основании оценок GEE-модели; для контроля ошибки первого рода при множественных сравнениях применяли поправку Холма. Расчёты выполнены в Excel 2020 и Python 3.13.5 (2026).

Результаты исследования и их обсуждение

Плотность расположения COL1A1 клеток в очаге повреждения в дерме кожи свидетельствует о степени синтеза коллагена I типа, основного белка внеклеточного матрикса [15-17].

У животных после моделирования травмы число коллагенообразующих клеток не увеличивалось на первых сроках исследования (14-е сутки). На 21, 28 и 45-й день наблюдения происходило увеличение числа COL1A1 клеток по сравнению с группой интактного контроля (табл.).

У животных после однократного применение секретома (III и IV экспериментальные группы) стромальных клеток на всех сроках исследования выявлено увеличение плотности расположения COL1A1-позитивных клеток дермы. Обращает внимание, что исследуемый показатель увеличивался на 14-е и 28-е сутки (p<0,001) у животных при инъекционном введении секретома по сравнению с животными после топического применения препарата.

Плотность COL1A1-позитивных клеток дермы при различных режимах применения секретома, клеток/мм²

Примечание. I группа - интактный контроль; II группа - повреждение кожи без терапии; III, V, VII группы - инъекционное введение Re:Q; IV, VI, VIII группы - топическое нанесение Re:Q. pк - скорректированное p при сравнении с I группой.

Экспрессия COL1A1 в регенерирующей коже крыс на 45-е сутки: A - II группа; B - VIII группа; C - VII группа. Иммуногистохимическое окрашивание: антитела к COL1A1, хромоген DAB, докраска гематоксилином; об×40, ок.×10

Одним из механизмов увеличения COL1A1+ клеточной популяции является непосредственное воздействие внеклеточных везикул на дермальные фибробласты. C. Li с соавт. показали, что экзосомы мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани дозозависимо усиливали пролиферацию и миграцию фибробластов дермы. При этом происходило увеличение содержания в фибробластах мРНК и коллагена I и III типов [15; 16].

Механизм влияния экзосом связан с увеличением WNT2b и β-катенина. При этом блокирование β-катенина (ингибитором XAV939) ослабляло регенеративный эффект экзосом [15]. Обращает внимание, что влияние секретома на компоненты межклеточного матрикса, клетки соединительной ткани зависит от фазы регенеративного процесса. Так, в эксперименте in vivo после введения экзосом экспрессия коллагена I и III типов была повышена на ранней стадии заживления, достигая максимальных значений приблизительно к 5-м суткам. На поздних сроках эффект изменялся: экспрессия коллагена снижалась, а волокна приобретали более зрелую организацию [16].

При трехкратном применении секретома происходило увеличение COL1A1+ клеток, более выраженное, чем при однократном введении, о чем свидетельствует значимое увеличение данного показателя на 21, 28, 45-е сутки исследования у животных после инъекционного введения секретома по сравнению с их количеством в эти сроки после топического нанесения препарата.

Согласно полученным результатам, при пятикратном введении секретома выявлено увеличение COL1A1+ клеток у животных при инъекционном (28-е и 45-е сутки) и топическом (28-е сутки) введении по сравнению с животными после моделирования травмы, но без влияния секретома. L. Wang с соавт. (2017) выявили: после воздействия экзосом мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани на фибробласты дермы происходило снижение экспрессия COL1A1 и α-SMA. В то же время выявлено увеличение COL3A1, TGF-β3, MMP1 и MMP3 [17]. R. Tutuianu с соавт. (2021) обнаружили увеличение экспрессии генов коллагена I и III типов при воздействии TGF-β1. Экзосомы препятствовали этому увеличению: экспрессия COL1A1 и COL3A1 снижалась приблизительно на 25% относительно TGF-β1-стимулированных клеток [18]. Вместе с тем воздействие экзосом приводило к уменьшению отложения коллагена in vivo [19]. Согласно современным представлениям, экзосомы мезенхимальных стромальных клеток пупочного канатика регулировали функциональную активность фибробластов (в том числе дифференцировку миофибробластов) [20], осуществляли регуляцию коллагенового обмена и уменьшали апоптоз посредством регуляции Bax, Bcl-2 и каспазы-3 [21].

Механизм антифибротического действия экзосом может реализовываться также через активацию и взаимодействие TGF-β и Hippo/YAP сигнальных путей. Y. Fu с соавт. (2025) при одноклеточном транскриптомном анализе механически поврежденной кожи идентифицировали фибробластические кластеры, экспрессирующие Col1a1, Col1a2 и Col3a1 [22].

Таким образом, влияние секретома приводило к увеличению числа фибробластов в дерме. Количество введений/нанесений секретома приводило к более выраженному увеличению числа клеток. Механизм увеличения числа фибробластов связывают с усилением миграции фибробластов в область повреждения, усилением их пролиферации и повышением синтеза коллагена I в отдельных клетках [15; 16; 21]. МикроРНК и белки экзосом способны подавлять избыточную TGF-β/Smad- и YAP-зависимую трансформацию фибробластов в миофибробласты, снижать α-SMA и COL1A1 и регулировать соотношение компонентов внеклеточного матрикса [17; 20; 22].

Заключение

Секретом мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани приводит к увеличению числа коллаген-продуцирующих (COL1A1+) клеток у животных после инъекционного и топического применения.