Введение

Оксидативный стресс играет ключевую роль в процессе заживления ран, влияя на различные аспекты воспаления, пролиферации клеток и ремоделирования тканей [1; 2]. В процессе воспалительного ответа активные формы кислорода (АФК), с одной стороны, играют положительную роль: активация и усиление иммунного ответа, уничтожение микроорганизмов, удаление некротизированных тканей, регуляция процесса ангиогенеза и образование новой соединительной ткани. Однако избыточное образование АФК может усугублять воспалительный ответ и приводить к значительным повреждениям и развитию хронических незаживающих дефектов [3], что представляет собой одну из наиболее острых проблем современной медицины и здравоохранения [4; 5]. Ключевым звеном патогенеза длительно незаживающих ран является оксидативный стресс - состояние, при котором избыточная продукция активных форм кислорода (АФК) значительным образом превышает возможности естественной антиоксидантной системы защиты [6]. Гиперпродукция АФК ведет к деструкции внеклеточного матрикса, перекисному окислению липидов мембран и апоптозу фибробластов, что критически замедляет процессы регенерации [7].

Одной из терапевтических стратегий в разработке средств для регенерации ран является применение антиоксидантов, способных не просто элиминировать АФК, но и длительно функционировать в условиях агрессивной прооксидантной микросреды. В этом контексте особый интерес представляют наночастицы диоксида церия, обладающие свойством переменной валентности и миметической активностью ферментов антиоксидантной защиты [8-10]. В отличие от классических антиоксидантов оксид церия выступает в роли каталитического антиоксиданта, что потенциально может обеспечивать пролонгированный эффект. Но стоит отметить, что результаты ряда исследований в значительной степени разнятся, что, вероятно, зависит от метода синтеза и выбора стабилизаторов наночастиц, которые сами по себе не являются инертными [11; 12], поэтому важно принимать во внимание и эффекты самих модифицирующих агентов. Наиболее часто для этой цели применяют полисахариды [13; 14] и карбоновые кислоты, а именно лимонную кислоту. Несмотря на то, что использование лимонной кислоты в качестве стабилизатора наночастиц диоксида церия подробно описано в литературе и довольно хорошо изучено [15; 16], в настоящей работе впервые применяется комбинированный подход модификации золей лимонной кислотой и гиалуронатом натрия [17], что потенциально может отражаться на биологических эффектах наноцерия, в том числе на его антиоксидантной активности, и определяет ключевой научный аспект работы.

Для оценки антиоксидантной активности золей выбор метода имеет важное значение. Стоит отметить, что прямое определение свободных радикалов классическими аналитическими методами затруднено из-за их высокой реакционной способности, неустойчивости и крайне низкой стационарной концентрации в среде. Среди существующих методов детекции АФК метод хемилюминесценции (ХЛ) является одним из предпочтительных. Он отражает кинетику процесса в реальном времени и способен эффективно регистрировать даже самые активные короткоживущие радикалы, концентрация которых в изучаемой системе может быть критически низкой. Это делает ХЛ–анализ уникальным и высокочувствительным инструментом [18].

Таким образом, целью настоящего исследования была сравнительная оценка антиоксидантной активности оригинальных золей наночастиц диоксида церия, а также компонентов, применяемых для модификации поверхности наночастиц, методом хемилюминесцентного анализа в двух модельных реакциях in vitro: в реакции Фентона (как модели каталитической генерации гидроксильного радикала) и в системе АБАП (2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорид)-люминол, отражающих два разных, но взаимосвязанных механизма свободнорадикального повреждения, с последующим выбором наиболее эффективного золя и его оптимальной концентрации в перспективе разработки средств для заживления ран.

Материалы и методы исследования

Для данного исследования были синтезированы два золя диоксида церия, стабилизированных лимонной кислотой (СеО2Цит) и комбинацией гиалуроната натрия и лимонной кислоты (СеО2ЦитГNa). В первую очередь готовились два раствора прекурсора оксида церия: 1,086 г Ce(NO3)3*6H2O (99,99%, «ЛАНХИТ», РФ) растворяли в 50 мл воды дистиллированной. Затем при непрерывном перемешивании вводили стабилизаторы: в первом случае 0,48 г лимонной кислоты, во втором случае добавляли 5 мл предварительно приготовленного раствора (60 мл) из 4 г гиалуроната натрия (молекулярная масса < 5000Да) (Glentham Life Sciences Ltd, Великобритания) и 6 г лимонной кислоты (≥ 98%, Sigma-Aldrich, США). К полученным растворам быстро приливали 100 мл 3 М водного раствора аммиака. Растворы оставляли для гидролиза на 24 часа. После наночастицы оксида церия осаждали избытком изопропанола (ХимМед, Россия) и центрифугировали при 15 000 об./мин. в течение 5 минут. Полученный осадок редиспергировали в дистиллированной воде и определяли концентрацию методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (Elan DRC-e, Perkin Elmer, Испания). Значение pH каждого из исследуемых золей составляло 5,5. Стабильность образцов контролировали в течение трех месяцев после синтеза при хранении в стандартных условиях при комнатной температуре: в течение всего периода наблюдения золи оставались агрегативно и седиментационно устойчивыми. Золи также были охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с использованием электронного микроскопа JEM 2100 (JEOL Ltd., Токио, Япония) и динамического светорассеяния на приборе Photocor Compact-Z (ООО «Фотокор», Москва, РФ). По данным ПЭМ, размеры наночастиц золей CeO2Цит и CeO2ЦитГNa не превышали 3,5 нм (рис. 1).

Рис. 1. Изображения ПЭМ для золей диоксида церия СеО2Цит и СеО2ЦитГNa

Дзета-потенциал и гидродинамический радиус наночастиц для золя СеО2Цит составляли от -10 до -20 мВ и 5,00 нм (100%) соответственно. Для золя СеО2ЦитГNa дзета-потенциал составлял -23,9 мВ, а гидродинамический радиус был представлен двумя пиками: 1,70 нм (10,6%) и 4,66 нм (89,3%).

Антиоксидантную активность золей определяли методом хемилюминесцентного анализа в двух модельных реакциях: в реакции Фентона и в реакции термического разложения АБАП в присутствии люминола.

Антиоксидантную активность золей в реакции Фентона определяли на хемилюминометре Lum-100 (ДИСофт, РФ) с использованием программного обеспечения PowerGraph 3.3.12. Готовили раствор сульфата железа (II) с концентрацией 10-3 М (ч., «Русхим», РФ), подкисленный серной кислотой (pH=2) (х.ч., «Сигма Тек», РФ), и отбирали 100 мкл. Затем в пробу добавляли 100 мкл раствора L-метионина (фармакопейный класс, «ПанЭко», РФ) в концентрации 4*10-5 М и 2200 мкл воды дистиллированной, также подкисленной раствором серной кислоты (pH=2). Для контрольного опыта в пробирку вводили 100 мкл раствора пероксида водорода с концентрацией 3⋅10-3 М и сразу начинали регистрацию хемилюминесценции. Синтезированные золи, модифицирующие компоненты, а также антиоксидант сравнения (аскорбиновая кислота (сверхчистая, 99,7% Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd, Индия)) добавляли в объеме 100 мкл до момента добавления перекиси водорода в концентрациях 10-2, 10-3, 10-4 М, объем дистиллированной воды в этом случае составлял 2100 мкл, а конечный объем пробы – 2500 мкл. Конечные концентрации исследуемых образцов в кювете составляли 4*10-4 М (при добавлении образцов в концентрации10-2 М), 4*10-5 М (при добавлении образцов в концентрации10-3 М), 4*10-6 М (при добавлении образцов в концентрации10-4 М) (для золей диоксида церия - в расчёте на CeO2, для гиалуроната натрия - в расчёте на мономерное звено, аскорбиновой кислоты, а также лимонной кислоты в расчёте на моногидрат).

Антиоксидантную активность золей исследовали методом термического разложения АБАП в присутствии люминола с использованием 12-канального хемилюминометра Lum-1200 («ДИСофт», РФ). В пробирку вводили 50 мкл 9,0 мМ люминола («Ленреактив», РФ), 200 мкл 20 мг/мл раствора AБAП (Sigma-Aldrich, США). Затем добавляли 20 мкл исследуемых образцов в концентрациях 10-2 М, 10-3 М, 10-4 М. Объём доводили до 1000 мкл трис-буфером («Ренам», РФ). Антиоксидантом сравнения также была аскорбиновая кислота. Конечные концентрации исследуемых образцов в кювете составляли 10-3 М, 10-4 М, 10-5 М, при анализе проб в концентрациях 10-2 М, 10-3 М и 10-4 М соответственно. Регистрацию сигнала проводили в условиях термостатирования при температуре 37 °C.

Число измерений в обоих экспериментах для контрольных опытов, каждой исследуемой концентрации золей диоксида церия, модифицирующих компонентов и аскорбиновой кислоты составляло 10 параллельных технических повторов. Зависимость интенсивности излучения выражалась в относительных единицах kPPS (килоимпульсы в секунду). На графиках хемилюминесценции, а также в приведенных таблицах и данных указаны концентрации вносимых растворов, добавляемых в строго фиксированном объёме 100 мкл.

Статистическая обработка данных проведена с помощью программы SPSS 25.0 (IBM Company, США). При оценке антиоксидантной активности данные были представлены в виде площади под кривой хемилюминесценции (AUC) и средней разницы площадей () под кривой ХЛ от контроля для межгрупповых сравнений и выражались в килоимпульсах (kPP). Прежде всего была оценена нормальность распределений показателей по критерию Шапиро - Уилка. Так как все данные были распределены нормально, они были представлены в виде среднего значения, стандартного отклонения, минимума, максимума. Для сравнительного анализа подгрупп был выполнен однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Одним из значимых свойств наночастиц оксида церия для эффективной регенерации ран является его антиоксидантная активность, так как избыточная и неконтролируемая продукция АФК приводит к инициации каскада окислительных реакций, которые лежат в основе выраженных повреждений тканей и хронизации раневого процесса [19]. Антиоксидантные свойства наночастиц диоксида церия обусловлены их переменной валентностью и способностью к цикличной смене фаз Ce3+ и Ce4+, что позволяет им эффективно нейтрализовать АФК [20; 21] и действовать достаточно продолжительное время. Несмотря на перспективность применения наночастиц оксида церия в биомедицине, обоснованность их использования в терапии ран требует четкого понимания механизмов действия в условиях моделирования конкретных звеньев свободнорадикального повреждения. В частности, способность эффективно ингибировать генерацию радикалов в реакции Фентона, имитирующей каталитическое расщепление H₂O₂ в присутствии железа [22]. Данная реакция развивается в первые часы повреждения тканей и сопровождает острую фазу воспалительного ответа. Если данная реакция протекает бесконтрольно, то это приводит к нарушению регенерации и хронизации раневого процесса. Кроме того, важно оценить способность оксида церия перехватывать органические пероксильные радикалы, генерируемые в системе термического разложения АБАП [23].

В нашей работе мы исследовали антиоксидантную активность не только двух синтезированных золей, но и активность модифицирующих компонентов, а также оксида церия без дополнительных модификаций поверхности наночастиц методом ХЛ: в модельной реакции Фентона и в реакции активированной хемилюминесценции с использованием AБAП.

По результатам исследования in vitro в реакции Фентона золи диоксида церия проявляли дозозависимую антиоксидантную активность. Данные описательной статистики приведены в таблице 1, графики ХЛ приведены на рисунке 2.

Таблица 1

Данные описательной статистики антиоксидантной активности, представленные в виде площадей под кривой ХЛ (AUC, kPP - килоимпульсы), аскорбиновой кислоты (антиоксидант сравнения), золей оксида церия и компонентов, применяемых для их модификации, в реакции Фентона

Примечание. Число измерений для каждой пробы составляло 10.

Рис. 2. Графики ХЛ в реакции Фентона для контрольного опыта, аскорбиновой кислоты (антиоксидант сравнения), золя диоксида церия, модифицированного гиалуронатом натрия и лимонной кислотой, золя диоксида церия, модифицированного лимонной кислотой, диоксида церия без дополнительных модификаций и модифицирующих компонентов в концентрациях 10-2, 10-3, 10-4 М

Золь CeO2ЦитГNa в концентрации 10-2 М подавлял уровень ХЛ в среднем на 91,8% (р < 0,05), статистически значимых отличий между его антиоксидантной активностью и аскорбиновой кислотой в аналогичной концентрации не было зарегистрировано. При этом его антиоксидантная активность была выше, чем у модифицирующих компонентов: в 3,2 (р < 0,05) и 1,7 (р < 0,05) раза выше, чем у лимонной кислоты и гиалуроната натрия соответственно. Золь CeO2Цит в концентрации 10-2 М обладал умеренной антиоксидантной активностью и подавлял уровень ХЛ в среднем на 17,4% (р < 0,05) и уступал по активности аскорбиновой кислоте и модифицирующему компоненту - лимонной кислоте. Диоксид церия без модификаций в концентрации 10-2 М подавлял уровень ХЛ в среднем на 49,2% (р < 0,05) (рис. 3).

Рис. 3. Разница средних площадей под кривой ХЛ () от контрольного опыта в модельной реакции Фентона для золей оксида церия и модифицирующих компонентов в концентрации 10-2 М. Антиоксидант сравнения аскорбиновая кислота в концентрации 10-2 М. Примечание: * – отличие от контроля (p < 0,05); # – отличие от аскорбиновой кислоты (p < 0,05) с учетом поправки Бонфферони на множественные сравнения

Золь CeO2ЦитГNa в концентрации 10-3 М обладал уже менее выраженной антиоксидантной активностью и подавлял уровень ХЛ в среднем на 56,3% (р < 0,05), а его эффективность была выше, чем у гиалуроната натрия и лимонной кислоты. Также в данной концентрации он был в 3,7 раза (р < 0,05) эффективнее аскорбиновой кислоты в аналогичной концентрации. Золь CeO2Цит в концентрации 10-3 М подавлял уровень ХЛ в среднем на 15,6% (р < 0,05), статистически значимых отличий между антиоксидантной активностью данного золя и лимонной и аскорбиновой кислотами не было зарегистрировано. Диоксид церия без модификаций в концентрации 10-3 М подавлял уровень ХЛ в среднем на 31,6% (р < 0,05) и был эффективнее аскорбиновой кислоты в 2,1 раза (р < 0,05) (рис. 4).

Рис. 4. Разница средних площадей под кривой ХЛ () от контрольного опыта в модельной реакции Фентона для золей оксида церия и модифицирующих компонентов в концентрации 10-3 М. Антиоксидант сравнения аскорбиновая кислота в концентрации 10-3 М.Примечание: * – отличие от контроля (p < 0,05); # – отличие от аскорбиновой кислоты (p < 0,05) с учетом поправки Бонфферони на множественные сравнения

Золь CeO2ЦитГNa в концентрации 10-4 М обладал низким, но статистически значимым уровнем антиоксидантной активности и подавлял уровень ХЛ в среднем на 5,5% (р < 0,05). Золь CeO2Цит в концентрации 10-4 М также проявлял слабые антиоксидантные свойства и подавлял уровень ХЛ в среднем на 2,4% (р < 0,05). Диоксид церия без модификаций проявлял слабые прооксидантные свойства и повышал уровень ХЛ на 3,0% (р < 0,05) (рис. 5).

Рис. 5. Разница средних площадей под кривой ХЛ () от контрольного опыта в модельной реакции Фентона для золей оксида церия и модифицирующих компонентов в концентрации 10-4 М. Антиоксидант сравнения аскорбиновая кислота в концентрации 10-4 М.Примечание: * – отличие от контроля (p < 0,05); # – отличие от аскорбиновой кислоты (p < 0,05) с учетом поправки Бонфферони на множественные сравнения

По результатам оценки антиоксидантной активности золей в системе АБАП–люминол они также проявляли дозозависимый эффект (табл. 2, рис. 6).

Таблица 2

Данные описательной статистики антиоксидантной активности, представленные в виде площадей под кривой ХЛ (AUC, kPP), аскорбиновой кислоты (антиоксидант сравнения), золей оксида церия и компонентов, применяемых для их модификации, в реакции термического разложения АБАП.

Примечание. Число измерений для каждой пробы составляло 10.

Рис. 6. Графики ХЛ в реакции термического разложения АБАП для контрольного опыта, аскорбиновой кислоты (антиоксидант сравнения), золя диоксида церия, модифицированного гиалуронатом натрия и лимонной кислотой, золя диоксида церия, модифицированного лимонной кислотой, диоксида церия без дополнительных модификаций и модифицирующих компонентов в концентрациях 10-2, 10-3, 10-4 М

Золь CeO2ЦитГNa в концентрации 10-2 М снижал уровень ХЛ на 99,9% (р < 0,05), его эффективность была эквивалентна аскорбиновой кислоте в той же концентрации. Его антиоксидантная активность в данной реакции вновь была выше, чем у лимонной кислоты и гиалуроната натрия. Золь CeO2Цит в концентрации 10-2 М эффективно снижал уровень ХЛ в среднем на 99,2% (р < 0,05) в сравнении с контрольным опытом и не уступал по антиоксидантной активности аскорбиновой кислоте. Также он был эффективнее модифицирующего компонента - лимонной кислоты. Диоксид церия в концентрации 10-2М (без модификаций) в реакции термического разложения АБАП подавлял уровень ХЛ в среднем на 67,6% (р < 0,05) (рис. 7).

Рис. 7. Разница средних площадей под кривой ХЛ () от контрольного опыта в реакции термического разложения АБАП для золей оксида церия и модифицирующих компонентов в концентрации 10-2 М. Антиоксидант сравнения аскорбиновая кислота в концентрации 10-2 М.Примечание: * – отличие от контроля (p < 0,05);

# – отличие от аскорбиновой кислоты (p < 0,05) с учетом поправки Бонфферони на множественные сравнения

Золь CeO2ЦитГNa в концентрации 10-3 М по-прежнему сохранял свою выраженную способность снижать уровень ХЛ и в среднем подавлял ее на 98,2% (р < 0,05), его антиоксидантная активность была выше, чем у компонентов, применяемых для модификации, и аскорбиновой кислоты. Золь CeO2Цит в концентрации 10-3 М обладал уже менее выраженной антиоксидантной активностью, чем в концентрации 10-2 М, и снижал уровень ХЛ на 84,1% (р < 0,05) и был эквивалентен по эффективности аскорбиновой кислоте. Диоксид церия без модификаций в концентрации 10-3 М снижал уровень ХЛ в среднем на 33,2% (р < 0,05) (рис.8).

Рис. 8. Разница средних площадей под кривой ХЛ () от контрольного опыта в реакции термического разложения АБАП для золей оксида церия и модифицирующих компонентов в концентрации 10-3 М. Антиоксидант сравнения аскорбиновая кислота в концентрации 10-3 М.Примечание: * – отличие от контроля (p < 0,05); # – отличие от аскорбиновой кислоты (p < 0,05) с учетом поправки Бонфферони на множественные сравнения

Золь CeO2ЦитГNa в концентрации 10-4 М демонстрировал стабильно высокий уровень антиоксидантной активности и подавлял уровень ХЛ в среднем на 84,1% (р < 0,05) и был эффективнее аскорбиновой кислоты и модифицирующих компонентов. Золь CeO2Цит в концентрации 10-4 М проявлял менее выраженные антиоксидантные свойства и снижал уровень ХЛ в среднем на 27,9% (р < 0,05). Диоксид церия без модификаций в концентрации 10-4 М в реакции термического разложения АБАП проявлял слабые статистически незначимые прооксидантные свойства и повышал уровень ХЛ на 8,4% (рис. 9).

Рис. 9. Разница средних площадей под кривой ХЛ () от контрольного опыта в реакции термического разложения АБАП для золей оксида церия и модифицирующих компонентов в концентрации 10-4 М. Антиоксидант сравнения аскорбиновая кислота в концентрации 10-4 М.Примечание: * – отличие от контроля (p < 0,05); # – отличие от аскорбиновой кислоты (p < 0,05) с учетом поправки Бонфферони на множественные сравнения

Таким образом, по результатам нашего исследования, оба синтезированных золя в обеих реакциях проявляли дозозависимую антиоксидантную активность. Использованный нами метод ХЛ–анализа позволил оценить антиоксидантные свойства золей и провести быстрый скрининг способности наночастиц перехватывать свободные радикалы. Полученные данные хорошо согласуются с результатами других научных исследований, в том числе выполненными с привлечением иных методов анализа [24-26].

Стоит отметить, что антиоксидантные свойства золей значительно отличались между собой. Принимая во внимание тот факт, что в исследовании использовался диоксид церия, можно предположить, что важным является не только химическая формула, но и выбор стабилизатора [11; 27; 28], который может влиять на биологическую активность наночастиц. Наиболее эффективным антиоксидантом в реакциях Фентона и термического разложения АБАП был золь CeO2ЦитГNa: во всех трех концентрациях он превосходил эффективность модифицирующих компонентов и оксида церия без модификаций. Золь CeO2Цит проявлял умеренную антиоксидантную активность в реакции Фентона, но более эффективно снижал уровень ХЛ в системе АБАП–люминол.

Интересным наблюдением было то, что оксид церия без модификаций проявлял более высокий уровень антиоксидантной активности в реакции Фентона, чем золь CeO2Цит в концентрациях 10-2, 10-3 М, тогда как в концентрации 10-4 М он проявлял себя как прооксидант в обеих реакциях в отличие от CeO2Цит в аналогичной концентрации. Прооксидантный эффект оксида церия без модификаций в концентрации 10-4 М теоретически можно объяснить, во-первых, тем, что при низкой концентрации наночастиц радикалы кислорода не успевают нейтрализовываться и равновесие реакции смещается, во-вторых, сам кислород на поверхности оксида церия без модификаций может вступать в реакции с образованием радикалов. В реакции Фентона нейтрализация радикалов требует прямого участия ионов церия, поэтому более низкая эффективность золя CeO2Цит в сравнении с оксидом церия без модификации может быть объяснена экранированием поверхности лимонной кислотой. В случае золя CeO2ЦитГNa результаты были противоположными, вероятно, из-за того, что данная комбинация стабилизаторов способствует «раскрытию» поверхности диоксида церия и обеспечивает более выраженный антиоксидантный эффект, что согласуется с результатами других исследований [29]. Для нейтрализации органических пероксильных радикалов, образующихся в системе АБАП–люминол, преимущественно необходим перенос атома водорода, донорами которого могут выступать как поверхностные гидроксильные группы, так и адсорбированные органические лиганды, поэтому оба золя были эффективнее, чем оксид церия без модифицирующего покрытия. Тем не менее этот вопрос остается открытым и заслуживает отдельного изучения с применением более специфических методов.

Останавливая выбор на золе CeO2ЦитГNa, так как он был более эффективен в обеих реакциях, важно определиться с концентрацией. В контексте заживления ран роль АФК парадоксальна и двойственна. С одной стороны, они обладают повреждающим действием, но в физиологических концентрациях выступают в качестве важных сигнальных молекул, без которых нормальный процесс регенерации невозможен [30]. Поэтому применение золя CeO2ЦитГNa в концентрации 10-2 М, который обладал выраженной антиоксидантной активностью, не рационально. В связи с этим для последующих исследований с целью потенциальной разработки средства для ранозаживления наиболее перспективным является золь CeO2ЦитГNa в концентрации 10-3 М.

Заключение

По результатам нашего исследования, синтезированные золи диоксида церия в обеих реакциях проявляли антиоксидантную активность. Но их эффективность значительно разнилась, что еще раз подтверждает значимость выбора модифицирующих компонентов. Наибольший антиоксидантный эффект наблюдался у золя CeO2ЦитГNa: он эффективно снижал уровень ХЛ в реакции Фентона и в реакции термического разложения АБАП во всех трех концентрациях. Но поскольку его высокая антиоксидантная активность в концентрации 10-2 М может потенциально оказать негативное влияние на процессы регенерации, так как радикалы кислорода выполняют и положительные функции, для последующих этапов работы выбрана концентрация 10-3 М. Именно она представляется наиболее перспективной для проведения дальнейших исследований с целью разработки ранозаживляющего средства.