Введение

В настоящее время в научной литературе всё большее внимание уделяется изучению возможностей использования различных вторичных метаболитов растений, грибов и микроорганизмов для профилактики и лечения онкологических заболеваний [1; 2]. Среди них особое место занимает индол-3-пропионовая кислота (ИПК) - вторичный метаболит, который синтезируется бактериями кишечника человека в результате ферментации аминокислоты триптофана [3]. Противоопухолевое действие ИПК реализуется на нескольких уровнях: она способна модулировать клеточные сигнальные пути, а также повышать общую устойчивость организма к воздействию патогенов и неблагоприятных факторов внешней среды [4]. Так, известно, что ИПК способствует снижению пролиферативной активности клеток рака молочной железы, сокращению содержания опухолевых стволовых клеток и маркеров эпителиально-мезенхимального перехода in vitro, а также и сокращению количества митозов в опухолях рака молочной железы и уменьшению метастазирования in vivo [5]. Кроме того, было показано, что ИПК, наряду с другими микробными метаболитами, может улучшать результаты лечения блокаторами контрольных точек иммунитета [6].

На данный момент о роли ИПК в патогенезе колоректального рака (КРР) известно относительно немного. Так, с одной стороны, ИПК известна своей способностью уменьшать воспаление в кишечнике и восстанавливать барьерную функцию эпителия кишечника – факторы, известные своим стимулирующим действием при развитии КРР [7]. С другой стороны, высокий уровень данного метаболита ассоциирован с развитием КРР [8]. Вероятно, данное противоречие связано с непрямым действием ИПК на клетки микроокружения опухоли, в частности макрофаги. Известно, что ИПК способствует индукции М2 поляризации макрофагов, что приводит к усилению подвижности, пролиферации и инвазии клеток КРР [9].

Из литературных источников известно, что наблюдаемая биологическая активность производных триптофана, к которым относится и ИПК, реализуется через взаимодействие с ядерными рецепторами - арилуглеводородным рецептором (AhR) и рецептором прегнана Х (PXR) [10]. Данные рецепторы управляют множеством клеточных сигнальных путей, поэтому конечный результат их активации зависит как от типа клетки, так и от молекулярного строения лиганда. В частности, одним из последствий их активации является усиленная экспрессия молекул, способствующих детоксикации, а значит и, потенциально, сокращению эффективности противоопухолевой лекарственной терапии [11].

Цель исследования. Исследовать цитостатическую активность индол-3-пропионата и его комбинаций с 5-фторурацилом в отношении культур клеток колоректального рака и её связь с активностью рецепторов AhR и PXR.

Материал и методы исследования

Клеточные культуры. В работе использовали культуры клеточных линий колоректальной карциномы мыши CT26 и колоректальной аденокарциномы человека HT-29, Caco-2 и HCT 116. Клетки культивировали в полной питательной среде DMEM (ServiceBio, Китай) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки («Биолот», РФ), 1% глутамина («Биолот», РФ), 1% пенициллина-стрептомицина («Биолот», РФ).

Исследование цитостатической активности. Для построения кривой «доза - ответ» клетки исследуемых культур высаживали в 96-луночные планшеты по 7х103 клетки на лунку. После адгезии клеток ко дну лунок среду культивирования заменяли на среду, содержащую индол-3-пропионовую кислоту (ИПК) (Sigma-Aldrich, США) в серии двукратных разведений от 500,0до 0,5 мкМ, а также контроль без добавления ИПК по 8 технических повторов для каждого опыта. Далее культивирование проводили 24 или 72 ч. Эксперимент повторили также в присутствии 5,0мкМ кетоконазола (КЕТ) (Sigma-Aldrich, США) или 5,0мкМ ресвератрола (РЕС) (Sigma-Aldrich, США).

Половинную ингибирующую концентрацию (IC50) для 5-фторурацила (5-ФУ) (ООО «Компания Деко», РФ) определяли путём построения кривых «доза - ответ», для чего в среду культивирования вносили 5-ФУ в серии двукратных разведений от 1000,0 до 1,0 мкМ, а также контроль без добавления 5-ФУ, по 8 технических повторов для каждого опыта. Далее планшеты культивировали 24 или 72 ч. Эксперимент повторили в трёх биологических повторах.

Провели оценку жизнеспособности с использованием МТТ-теста по стандартной методике [12]. Для каждого варианта опыта определяли жизнеспособность как отношение оптической плотности при 570 нм в опытных лунках к значению этого показателя в контрольных лунках, выраженное в процентах. Далее определяли IC50 с помощью онлайн-инструмента IC50 Calculator [13] с использованием 3-параметрической модели и нормализации на максимальный ответ.

Для исследования сочетанного цитостатического действия ИПК и 5-ФУ для каждой культуры было заложено: 1) контроль без добавления тестируемых соединений; 2) IC50 5-ФУ; 3) 0,5 мкМ ИПК + IC50 5-ФУ; 4) 4 мкМ ИПК + IC50 5-ФУ; 5) 32,0 мкМ ИПК+ IC50 5-ФУ; 6) 250,0 мкМ ИПК + IC50 5-ФУ. Эксперимент повторили также в присутствии 5,0мкМ КЕТ или 5,0мкМ РЕС. Всего было заложено по 8 технических повторов для каждого варианта опыта. Далее планшеты культивировали 24 или 72 ч, после чего проводили МТТ-тест по стандартной методике и определяли жизнеспособность по формуле, указанной выше. Эксперимент повторили в трёх биологических повторах.

Статистическая обработка результатов. Каждый эксперимент ставили трижды, и конечное значение жизнеспособности, а также IC50 определяли как среднее из трёх полученных независимых результатов ± стандартное отклонение. Сравнение средних значений проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Размер эффекта определяли с помощью коэффициента d Коэна. Для учёта поправки на множественное сравнение использовали метод Холма.

Результаты исследования и их обсуждение

Построение кривой «доза - ответ» для ИПК провели в диапазоне концентраций от 0,5 до 500,0 мкМ. Данные значения были подобраны на основании литературного поиска и охватывают естественные уровни ИПК в крови в норме и после приема внутрь высоких доз ИПК. Известно, что физиологический уровень ИПК в крови человека в среднем колеблется в пределах 0,5-4 мкМ в зависимости от состояния здоровья [14]. Так как авторам не удалось найти данные фармакологических исследований ИПК на человеке, то за ориентир были взяты данные, полученные в эксперименте на крысах, где было показано, что уровень ИПК в крови резко (до 51 раза) возрастает в первые 90 минут по сравнению с базовым уровнем 6,4мкМ после перорального приёма 200 мг/кг [15] (рис. 1).

Рис. 1. Цитостатическое действие ИПК в клеточных культурах КРР: А - культура HT-29; Б - культура Caco-2; В - культура HCT 116; Г - культура CT26. Концентрация КЕТ 5,0 мкМ, концентрация РЕС 5,0 мкМ (составлено авторами)

Во всех четырёх культурах наблюдалось значительное усиление жизнеспособности при экспозиции 24 ч. При этом в культурах HT-29 и HCT 116 увеличение оптической плотности по сравнению с контролем без добавления ИПК происходило уже при 20,0 мкМ, достигая своего пика при 500,0 мкМ. Отметим, что в культуре HT-29 максимальная разница с контролем составила более 40%, а в культуре HCT 116 разница была меньше и лежала в пределах 20-30%. Известно, что ИПК способна усиливать клеточное дыхание. Ранее этот эффект был обнаружен в лимфоцитах периферической крови мышей при пероральном приёме ИПК в дозе 200 мг/кг [16] и кардиомиоцитах мышей in vitro в диапазоне концентраций ИПК от 5 до 1000 мкМ [17; 18]. Вероятно, то же самое явление авторы зафиксировали и в эксперименте на культурах злокачественных клеток при экспозиции 24 ч, так как МТТ-тест, примененный для непрямого определения количества живых клеток, измеряет продукцию восстановленного НАДФ в митохондриях и прямо связан с уровнем энергетического метаболизма.

По истечении 72 ч экспозиции наблюдалось появление цитостатического эффекта во всех четырёх культурах при высоких концентрациях ИПК. При этом наибольшую чувствительность продемонстрировала культура CT26, в которой значение жизнеспособности при 500,0 мкМ ИПК составило 80,12±10,2%, а наименьшую – культура HT-29, в которой данный показатель составил 91,23±11,3%. Применение КЕТ и РЕС не оказало существенного влияния на наблюдаемые показатели жизнеспособности. Таким образом, полученных данных оказалось недостаточно для построения сигмовидной кривой и получения значения IC50. Данные концентрации превышают физиологический уровень ИПК в крови человека [14] и сопоставимы, вероятно, с фармакологическим уровнем, который, как показывают исследования на животных, может многократно превышать нормальный уровень после перорального приёма высоких доз ИПК [15].

Для исследования взаимодействия 5-ФУ и ИПК далее определили половинную ингибирующую концентрацию 5-ФУ для каждой клеточной линии и экспозиций 24 и 72 ч путём построения кривых «доза - ответ» (графики не приведены). Во всех культурах удалось получить типичные сигмовидные кривые и вычислить значение IC50, результаты представлены в таблице.

Половинная ингибирующая концентрация 5-фторурацила в культурах колоректального рака (мкМ)

Примечание. Составлено авторами по результатам исследования.

По результатам исследования, наиболее чувствительными к действию 5-ФУ оказались культуры CT26 и HT-29, а Caco-2 и HCT 116 продемонстрировали меньшую чувствительность.

Далее проводили исследование совместного действия 5-ФУ и ИПК путём сравнения жизнеспособности исследуемых культур в присутствии каждого соединения по отдельности и при совместном применении. Опыт проводили без дополнительных воздействий и в присутствии КЕТ (5,0 мкМ) или РЕС (5,0 мкМ). Подобрали концентрации 5-ФУ близкие к IC50 для каждой культуры и времени экспозиции. Так, для культуры CT26 тестируемые дозы 5-ФУ составили 35,0 мкМ (24 ч) и 6,0 мкМ (72 ч), для HT-29 – 25,0 и 3,0 мкМ, для HCT 116 – 54,0 и 13,0 мкМ и для Caco-2 – 78,0 и 44,0 мкМ соответственно. Концентрации ИПК в данном эксперименте составили 0,5, 4,0, 32,0 и 250,0 мкМ.

Было показано, что при 24 ч экспозиции не наблюдалось статистически значимых различий в жизнеспособности исследуемых культур между 5-ФУ в самостоятельном применении и в сочетании с ИПК (данные не приведены). Однако при 72 ч экспозиции ИПК было обнаружено снижение цитостатической активности 5-ФУ в культурах HT-29 и HCT 116, в которых наблюдалось увеличение жизнеспособности при добавлении в среду культивирования 250,0 мкМ ИПК (рис. 2). Тем не менее, несмотря на большой эффект (dHT29 = 2,7; dHCT116 = 3,6), после применения поправки на множественное сравнение Холма - Бонферрони разница между средними значениями оказалась недостоверной при пороге допустимой ошибки α=0,05. При этом наблюдаемый эффект полностью блокировался применением блокатора PXR кетоконазола, но не блокатора AhR ресвератрола.

Рис. 2. Цитостатическое действие 5-ФУ в сочетании с ИПК на культуры клеточных линий КРР: А - культура HT-29; Б - культура Caco-2; В - культура HCT 116; Г - культура CT26. Экспозиция 72ч. Концентрации ИПК приведены в мкМ. Концентрации 5-ФУ см. в тексте. Концентрация КЕТ 5,0 мкМ, концентрация РЕС 5,0 мкМ (составлено авторами)

Значение индекса HSA для сочетаний 5-ФУ и 250 мкМ ИПК составило в культуре HT-29 1,35 без применения ингибиторов, 1,1 при применении КЕТ и 1,34 при применении РЕС. Для культуры HCT 116 значение индекса составило 1,48 без применения ингибиторов, 1,04 при применении КЕТ и 1,38 при применении РЕС. Данные значения индекса HSA свидетельствуют о наличии антагонизма между двумя исследованными соединениями при данных концентрациях [19].

Наблюдаемое предполагаемое увеличение резистентности к 5-ФУ при действии высоких доз ИПК и длительной экспозиции, вероятно, связано с индукцией экспрессии генов-детоксикантов, например MDR1, которая проявляется при длительном инкубировании в присутствии ИПК и его воздействии на ядерные рецепторы, в частности PXR [20]. Возможная связь с сигнализацией PXR подтверждается тем фактом, что эффект усиления устойчивости к 5-ФУ блокировался применением блокатора PXR кетоконазола. При этом разная реакция исследуемых культур КРР на применение ИПК может быть связана с различиями в уровне экспрессии PXR. В частности, по литературным данным известно, что экспрессия данного рецептора снижена в культуре Caco-2, по сравнению с другими линиями КРР, что может приводить к менее выраженной реакции клеток на активацию этого рецептора [21]. Так как в своей работе авторы не исследовали уровень экспрессии ядерных рецепторов, то установить эту связь однозначно не можем. Несмотря на то, что полученные данные демонстрируют способность ИПК снижать цитостатический эффект 5-фторурацила в культурах колоректального рака, следует с осторожностью интерпретировать эти результаты в клиническом контексте. Модель in vitro не учитывает влияние опухолевого микроокружения, системного метаболизма препаратов и иммунного ответа пациента. В клинической практике эффективность полихимиотерапии является результатом сложного взаимодействия прямых и опосредованных механизмов регуляции [22].

Известно, что AhR прямо или косвенно контролирует экспрессию широкого спектра генов, участвующих в нескольких метаболических путях, таких как синтез липидов и холестерина, энергетический метаболизм, метаболизм ксенобиотиков и многочисленные транспортеры. Тем не менее из-за большого разнообразия механизмов связывания с практически неограниченным кругом лигандов конечный эффект от их взаимодействия с рецептором может варьировать в широких пределах, которое в итоге может либо способствовать канцерогенезу, либо ингибировать его [23]. Хотя известно, что ИПК относится к лигандам AhR, данное соединение всё же довольно слабо взаимодействует с рецептором даже при 1000,0 мкМ по сравнению со многими другими микробными метаболитами [24]. Таким образом, вероятно, наблюдаемое отсутствие интерференции ресвератрола с усилением устойчивости исследуемых культур к 5-ФУ под действием ИПК может быть связано как с низкой экспрессией AhR, так и со слишком слабой стимуляцией данного рецептора при протестированных концентрациях ИПК и длительности экспозиции в данных клеточных культурах.

Ограничения исследования. Данное исследование является разведочным. Несмотря на отмеченный заметный эффект ослабления действия 5-ФУ под действием высоких доз ИПК в двух из четырёх исследованных культур КРР, авторам не удалось продемонстрировать статистическую значимость полученных результатов из-за ограничения выборки (всего по три элемента в каждой выборке, соответствующих биологическим повторам) и большого количества попарных сравнений. Для преодоления данного ограничения будущее подтверждающее исследование будет проведено с большим количеством независимых повторов для культур и сочетаний, показавших наибольший эффект.

Заключение

Индол-3-пропионовая кислота при 250,0 мкМ и 72 ч экспозиции ассоциирована с умеренным снижением МТТ-регистрируемого цитостатического эффекта 5-ФУ в HT-29 и HCT 116. Предположительно, эта активность опосредована через сигнальный путь ядерного рецептора PXR, но не AhR. Кроме того, наблюдаемое усиление метаболической активности опухолевых клеток под действием ИПК может теоретически способствовать их выживаемости и пролиферации за счёт поддержания высокого уровня продукции АТФ и НАДФ+Н, что требует дальнейшего изучения в контексте комбинированной терапии.