Сетевое научное издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

Введение

Меланома представляет собой злокачественное новообразование, происходящее из меланоцитов – клеток нейроэктодермального происхождения, ответственных за синтез пигмента меланина. Патогенез меланомы является многофакторным процессом, требующим сложного взаимодействия экзогенных и эндогенных факторов риска [1].

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в течение последнего десятилетия отмечается значительный рост заболеваемости меланомой кожи [2]. По состоянию на 2024 г. в мире было зарегистрировано около 130000 новых случаев заболевания [3], из них в России порядка 5540 случаев [4, 5]. В связи с этим углубленное изучение генетических и молекулярных характеристик меланомы приобретает первостепенное значение для разработки новых, более эффективных стратегий таргетной терапии [6].

Ключевую роль в инициации и прогрессии меланомы кожи играет сигнальный каскад Ras-Raf-MEK-ERK митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) ( рис.1) [7].

Рис.1. Схема сигнального пути MAPK (Ras-Raf-MEK-ERK) при меланоме.

RTK – рецептор тирозинкиназы; SCF – стволовой фактор; EGF – эпидермальный фактор роста; RAS, RAF, MEK, ERK – ключевые белки сигнального пути MAPK.

Пунктирные стрелки – активация сигнального пути; красные Т-образные линии – точки приложения таргетных препаратов, блокирующих соответствующие киназы. Мутации RAS и BRAF приводят к конститутивной активации пути и стимулируют пролиферацию, выживание, миграцию и метастазирование опухолевых клеток.

Примечание: составлен авторами на основе источника [7]

Соответственно, меланома может быть классифицирована на основе молекулярного драйвера пути MAPK, который включаетBRAFи NRAS мутации [8]. Нарушение в функционировании этого пути приводит к постоянной активации передачи митогенных сигналов, что стимулирует неконтролируемую пролиферацию опухолевых клеток и способствует прогрессированию заболевания [9].

Наиболее частой генетической аберрацией при меланоме является мутация в гене BRAF, в частности замена валина глутаминовой кислотой в 600-м кодоне (V600E). Экспериментальные данные, полученные на трансгенных мышиных моделях с экспрессией BRAF V600E, убедительно доказывают, что данная мутация является драйверным событием в инициации опухолевого роста. Фармакологическое ингибирование мутантного белка BRAF приводит к блокированию пролиферации клеток меланомы, индукции апоптоза и подавлению роста опухолевых ксенотрансплантатов [10].

Эпидемиологические исследования демонстрируют корреляцию между типом мутации BRAF и характером воздействия ультрафиолетового излучения. Мутация V600E чаще ассоциирована с развитием меланомы у молодых пациентов с историей периодического интенсивного солнечного воздействия. В то же время мутация V600K более характерна для опухолей, возникающих на фоне хронического кумулятивного солнечного повреждения у лиц пожилого возраста [11].

Активация онкогена NRAS происходит вследствие точечных мутаций, наиболее часто затрагивающих кодоны 12 и 13 экзона 2, а также кодон 61 экзона 3. Прогностическое значение мутаций NRAS остается предметом научных дискуссий [12]. В то время как некоторые ранние исследования указывали на их ассоциацию с более благоприятным прогнозом и выживаемостью пациентов, более поздние работы свидетельствуют о том, что наличие мутации NRAS может быть независимым предиктором снижения выживаемости при IV стадии заболевания [13, 14].

Несмотря на значительные успехи в разработке комбинированной таргетной терапии ингибиторами BRAF и MEK, общее биологическое и прогностическое значение мутационного статуса генов BRAF и NRAS требует дальнейшего изучения.

Цель исследования – комплексная оценка выживаемости и определение мутационного статуса генов BRAF и NRAS в опухолевом материале пациентов с диагнозом «меланома кожи» для уточнения их роли в прогнозе заболевания.

Материал и методы исследования

В ретроспективное исследование включены взрослые пациенты (старше 18 лет) с морфологически верифицированной первичной или метастатической меланомой кожи, проходившие лечение в 2018–2024 гг. Критериями включения являлись наличие достаточного количества опухолевой ткани в парафиновых блоках (FFPE) для молекулярно-генетического исследования и доступность клинических данных. Критериями исключения служили отсутствие морфологической верификации диагноза, содержание опухолевых клеток менее 30% после микродиссекции, наличие синхронных или метахронных злокачественных новообразований другой локализации (за исключением carcinoma in situ) и отсутствие данных динамического наблюдения.

В исследование вошли 112 пациентов, в том числе 48 (42,9%) мужчин и 64 (57,1%) женщины. Средний возраст составил 58,2 ± 12,4 года (27–85 лет). Медиана толщины опухоли по Бреслоу составила 2,8 мм (0,8–6,5 мм), изъязвление выявлено у 45 (40,2%) пациентов. Для молекулярного анализа использовали образцы первичных опухолей (75; 67,0%) и метастатических очагов (37; 33,0%), преимущественно регионарных лимфатических узлов. У большинства пациентов функциональный статус соответствовал ECOG 0–1 (82,1%), повышение уровня ЛДГ отмечалось у 43 (38,4%) больных. Часть исследуемой когорты ранее использовалась для анализа мутационного статуса [5]; в настоящей работе впервые представлены результаты анализа клинических исходов и выживаемости.

Материалом исследования служили образцы опухолевой ткани FFPE. Перед выделением ДНК выполняли макро- и микродиссекцию для обеспечения содержания опухолевых клеток не менее 30%.

Геномную ДНК выделяли с использованием набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя. Контроль качества и количественную оценку ДНК проводили методами спектрофотометрии (NanoDrop) и флуориметрии (Qubit). Для дальнейшего анализа использовали образцы с отношением A260/A280 1,8–2,0 и концентрацией ДНК не менее 20 нг/мкл.

Мутацию BRAF V600E определяли методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Редкие варианты BRAF и мутации NRAS выявляли методом классической ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру (ABI Prism 3500, Applied Biosystems, США), охватывающим экзоны 2 и 3 гена NRAS. Предел чувствительности метода составлял 15–20% мутантных аллелей. В связи с небольшим числом пациентов с редкими вариантами мутаций анализ проводился на уровне мутационного статуса генов BRAF и NRAS.

Статистическую обработку данных выполняли в программе Statistica 13.0. Для сравнения качественных признаков использовали критерий χ² Пирсона, количественных – критерий Манна – Уитни. Общую (OS) и безрецидивную (PFS) выживаемость оценивали методом Каплана – Мейера с использованием Log-rank-теста. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В исследование были включены 112 пациентов с морфологически верифицированным диагнозом «меланома кожи». Гендерное распределение было следующим: 48 (42,9%) мужчин и 64 (57,1%) женщины. Средний возраст на момент постановки диагноза составил 58,2 ± 12,4 года (диапазон от 27 до 85 лет). Распределение по стадиям заболевания согласно классификации TNM 8 было следующим: II стадия – у 7 (6,3%) пациентов, III стадия – у 68 (60,7%), IV стадия – у 37 (33,0%) пациентов.

Мутации в исследуемых генах были выявлены у 78 (69,6%) пациентов. Общая структура мутационного профиля представлена на рис.2.

Рис.2. Частоты и типы мутаций в генах BRAF и NRAS.

Примечание: составлен авторами на основе полученных данных в ходе исследования

Сочетанные мутации в генах BRAF и NRAS в пределах одной опухоли не выявлены ни у одного пациента, что подтверждает их взаимную эксклюзивность.

Анализ локализации первичной опухоли выявил статистически значимую связь с мутационным статусом (χ²=24,7; p<0,001). У пациентов с мутациями в гене BRAF поражение кожи головы и шеи встречалось наиболее часто (62,1%, n=36/58), тогда как в группе дикого типа эта локализация наблюдалась лишь у 28,6% (n=10/34) пациентов. Аналогичная тенденция прослеживалась и для мутаций NRAS, хотя и с меньшей частотой (45,0%, n=9/20).

Митотическая активность (определяемая как наличие≥1 митоза в поле зрения) была достоверно выше в группе без мутаций (84,6%) по сравнению с группами BRAF-мутантных (63,4%) и NRAS-мутантных (66,7%) опухолей (p=0,002).

За период наблюдения (медиана 36 месяцев) прогрессирование заболевания было зафиксировано у 95 (84,8%) пациентов. Общая частота рецидивов составила 79,5%. Структура рецидивов и метастазирования в зависимости от мутационного статуса представлена на рис.3.

Рис.3. Прогрессирование заболевания в зависимости от наличия мутаций;

p-value – значение Х2-теста Пирсона для распределения сравнения распределения типов прогрессирования между группами (статистически значимые различия при p<0,05)

Примечание: составлен авторами на основе полученных данных в ходе исследования

Анализ выживаемости показал значимые различия между группами. Медиана общей выживаемости (OS) для всей когорты составила 48 месяцев. При этом пациенты с мутацией BRAF имели наихудший прогноз: медиана OS составила 39 месяцев против 58 месяцев в группе дикого типа (Log-rank test p=0,03). Группа с мутациями NRAS занимала промежуточное положение с медианой OS 52 месяца ( рис.4).

Рис.4. Кривые Каплана – Мейера общей выживаемости пациентов в зависимости от мутационного статуса генов BRAF и NRAS.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Наиболее значимым фактором неблагоприятного прогноза оказался рецидив поражения регионарных лимфатических узлов. В группе с мутацией BRAF этот показатель был достоверно выше (39,7%) по сравнению с группой дикого типа (17,6%, p=0,008), что позволяет рассматривать данный генотип как маркер высокого риска лимфогенного метастазирования.

Медиана выживаемости без прогрессирования для всей выборки составила 22 месяца. Кривые Каплана – Мейера продемонстрировали статистически значимое преимущество группы дикого типа (PFS=29 мес) над группой с мутацией BRAF (PFS=17 мес; p=0,01). Группа с мутациями NRAS показала промежуточные результаты (PFS=24 мес).

Таким образом, расширенный анализ данных на увеличенной выборке подтверждает доминирующую роль мутации BRAF как фактора неблагоприятного прогноза течения меланомы кожи.

Проведенное исследование на расширенной выборке подтверждает высокую частоту активирующих мутаций в генах BRAF и NRAS среди российских пациентов с меланомой кожи. Полученные данные (51,8% для BRAF) согласуются с результатами крупных международных метаанализов последних лет [15, 16].

Установленная ассоциация мутационного статуса с локализацией первичной опухоли на голове и шее может быть обусловлена особенностями этиопатогенеза опухолей данной локализации, возможно, связанным с характером инсоляции или генетической предрасположенностью меланоцитов этой области. Данная закономерность подтверждается результатами молекулярно-эпидемиологических исследований, показавших, что мутации в гене BRAF значительно преобладают в меланомах, возникающих на участках кожи, не подверженных хронической инсоляции. В частности, наиболее высокая частота мутаций BRAF (до 69,6%) отмечена в опухолях туловища (спина, грудь, передняя брюшная стенка), тогда как в меланомах кожи лица и шеи этот показатель составляет лишь 42,8%. В то же время, для опухолей, локализующихся на участках с хроническим солнечным повреждением, более характерны мутации в гене NRAS, которые встречаются здесь с частотой до 28,6% [17].

Ключевым результатом работы является подтверждение неблагоприятного прогноза у пациентов с мутацией BRAF. Именно эта когорта демонстрировала наибольшую частоту рецидивов поражения регионарных лимфатических узлов и отдаленного метастазирования. Данный феномен может быть объяснен более высокой пролиферативной активностью и инвазивным потенциалом опухолевых клеток, несущих данную аберрацию [18, 19].

В исследовании Tsao et al. (2012) было установлено, что наиболее частым событием является аберрантная активация гена BRAF в кодоне V600, которая наблюдается в 35–50% случаев меланомы. Реже встречаются мутации в гене NRAS, преимущественно затрагивающие кодоны Q61, а также G12 и G13 (10–25% опухолей) [20]. Мутации BRAF можно классифицировать на три группы: класс I, II или III [21]. Мутации класса I и класса II приводят к Ras-независимой активации Raf, при этом мутации класса I затрагивают V600, создавая мономеры с высокой киназной активностью, а мутации класса II создают активированные димеры Raf с промежуточной киназной активностью. В отличие от этого, мутации класса III включают более слабые онкогенные варианты, приводящие к усиленному связыванию Ras с нарушенной киназной активностью, что стимулирует активацию CRAF для усиления нисходящей передачи сигналов MAPK [22].

В настоящем исследовании группа пациентов с мутациями NRAS занимала промежуточное положение по показателям общей и безрецидивной выживаемости. Эти результаты соответствуют современным представлениям о биологии NRAS-мутантной меланомы. Несмотря на относительно неблагоприятный прогноз, некоторые исследования показывают более высокую чувствительность данной подгруппы пациентов к иммунной терапии по сравнению с BRAF-мутантными опухолями [23].

Следует отметить ряд ограничений, присущих данной работе. Ключевым из них является ретроспективный дизайн исследования, проведенного на базе одного клинического центра, что по своей природе сопряжено с методологическими ограничениями. Кроме того, детальный анализ данных наблюдения и терапии был проведен лишь для подгруппы из 112 пациентов, прошедших молекулярное профилирование. Гетерогенность исследуемой когорты, включавшей как метастатические, так и неметастатические очаги с вариабельными протоколами динамического наблюдения, существенно затрудняет экстраполяцию полученных результатов на другие клинические группы и их однозначную интерпретацию.

Однако полученные результаты подчеркивают необходимость обязательного молекулярно-генетического тестирования статуса BRAF/NRAS* на этапе первичной диагностики для стратификации риска и выбора оптимальной тактики лечения, включая раннее рассмотрение адъювантной таргетной терапии для пациентов высокого риска.

Заключение

Мутационный статус генов BRAF и NRAS ассоциирован с особенностями клинического течения и показателями выживаемости пациентов с меланомой кожи в исследуемой когорте. Наличие мутации BRAF было связано с менее благоприятными показателями общей и безрецидивной выживаемости, что свидетельствует о потенциальной клинической значимости молекулярно-генетического тестирования при выборе тактики лечения и динамического наблюдения. Полученные результаты требуют подтверждения в независимых проспективных когортах с использованием многофакторного анализа.