Сетевое научное издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

Введение

Бруцеллез – зоонозная инфекция с разными путями передачи, характеризующаяся незавершенным фагоцитозом, персистенцией возбудителя и склонностью к хроническому течению заболевания.

Незавершенный фагоцитоз при бруцеллезной инфекции приводит к развитию бактериемии и гематогенной циркуляции эндотоксина. Взаимодействие между защитными механизмами макроорганизма и компонентами бруцелл (липополисахарид) инициирует каскад реакций, приводящих к уничтожению патогена или его длительному сохранению в макрофагах и клетках ретикулоэндотелиальной системы. Развитие системного воспалительного ответа на фоне эндотоксинемии является одним из ведущих факторов патофизиологии течения бруцеллеза [1].

Центральным звеном, связывающим инфекционный процесс с нарушениями гемостаза и воспалением, выступает контактная система (представленная фактором XII, прекалликреином и высокомолекулярным кининогеном), основным компонентом которого является фактор Хагемана (фактор XII).

Фактор XII – гликопротеин, синтезируемый преимущественно в печени. При контакте с отрицательно заряженными поверхностями фактор XII активируется с образованием активной – XIIa. Он запускает внутренний путь свертывания крови, активируя фактор XI. XIIa превращает прекалликреин плазмы в калликреин, который, в свою очередь, высвобождает брадикинин из высокомолекулярного кининогена. Брадикинин является мощным медиатором воспаления, который увеличивает проницаемость сосудов, вызывает их расширение и стимулирует хемотаксис, эти эффекты имеют ключевое патофизиологическое значение при септических и аллергических состояниях [2].

Липополисахариды (ЛПС), являясь ключевыми компонентами мембраны бактерий, запускают активацию XII фактора свертывания крови, обеспечивая прямую связь между бактериальной инфекцией, процессами свертывания крови и развитием воспаления [3].

ЛПС могут влиять на свертываемость крови, в том числе за счет активации контактного пути [4, 5]. Структурная гетерогенность ЛПС различных возбудителей оказывает влияние на механизмы активации свертывания крови [4].

Бактерии могут активировать контактную систему либо путем прямого связывания, либо опосредованно, высвобождая медиаторы воспаления [6]. Активация контактной системы фактором XII инициирует внутренний путь свертывания крови и калликреин-кининовую систему, что приводит к запуску процессов свертывания и воспаления [7].

Дефицит фактора XII препятствует тромбообразованию у животных, не вызывая при этом чрезмерных кровотечений [5]. Экспериментальные данные доказывают, что именно активная форма фактора (XIIa) играет ключевую роль в патогенезе тромбообразования [8]. Ингибирование или дефицит фактора XII ограничивает активацию прекалликреина, тем самым подавляя провоспалительные каскады и снижая риск тромботических осложнений [9].

Дефицит фактора свертывания крови XII может ингибировать процесс образования тромбов, что непосредственно зависит от вида патогена и структуры его антигенных детерминант. Существует предположение, что фактор XII способен распознавать патогены, действуя как рецептор, связываясь с определенными участками на поверхности микроорганизмов [10].

Фактор Хагемана является маркером, связывающим процессы гемостаза, фибринолиза и воспаления. Активированный фактор XII запускает внутренний путь свертывания крови, через калликреин-кининовую систему участвует в образовании брадикинина, регуляции проницаемости сосудов и ответа на воспаление и инфекцию, а также прямо или опосредованно через калликреин активирует плазминоген, запускающий процесс фибринолиза.

Таким образом, фактор свертывания крови XII вызывает различные прокоагулянтные и провоспалительные реакции, которые по-разному влияют на инфекционный процесс.

Цель исследования – определение патофизиологического значения фактора Хагемана при остром бруцеллезе.

Материал и методы исследования

Объект исследования – клинический материал от 32 пациентов с лабораторно подтвержденным острым бруцеллезом. Образцы крови были получены при поступлении больных в стационар. Группу контроля составили здоровые доноры (n=34), не переболевшие бруцеллезом и не вакцинированные против этой инфекции.

Отбор и рандомизацию больных бруцеллезом производили в соответствии с индивидуальными регистрационными картами больных (истории болезни), с учетом классификации клинических форм бруцеллеза по Г.П. Рудневу (1955). Все больные острым бруцеллезом имели среднюю степень тяжести течения болезни, в фазе компенсации.

Критерии исключения из исследования: острые инфекционные заболевания, обострение тяжелых соматических заболеваний, опухоли любой локализации, аутоиммунные заболевания, диффузные заболевания соединительной ткани.

Среди обследованных преобладали мужчины (70 %), при этом различие показателей в зависимости от пола в обследуемых группах не имело статистической значимости, что позволило объединить их в одну группу без учета половой принадлежности. Возраст обследованных находился в диапазоне от 18 до 69 лет.

Все обследуемые дали информированное добровольное согласие на участие в настоящих исследованиях (согласно Федеральному закону «Об основах охраны здоровья граждан в РФ» от 21 ноября 2011 г. №323-ФЗ, ред. от 30 декабря 2021 г.). Клинические исследования одобрены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России (заключение локального этического комитета №109 от 19 мая 2022 г.).

Преаналитический этап лабораторных исследований проводили в соответствии с существующими приказами и рекомендациями Министерства здравоохранения РФ по контролю качества лабораторных исследований. Образцы венозной крови забирали утром натощак в пробирку с 3,8% (0,129 М) раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 с забираемой кровью и доставляли в лабораторию. Обеззараживание исследуемого материала (крови) осуществляли в соответствии СанПин 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

Материалом для исследования служила плазма крови. Определение фактора свертывания крови (фактор XII) проводили на автоматическом анализаторе гемостаза STA Compact (Roche diagnostics, Франция), с применением следующих наборов реагентов: STA®-ImmunoDef XII (иммунодефицитная плазма человека, используемая для исследования активности фактора XII в цитратной плазме). Для проведения контроля качества клоттинговых исследований фактора свертывания крови применяли системную универсальную контрольную плазму STA®-System Control N+P (STAGO, Франция, Ирландия). В качестве калибровочной плазмы применили калибратор STA®-Unicalibrator (STAGO, Франция). При проведении анализа анализатор автоматически выполняет необходимое разведение исследуемой плазмы с использованием буфера STA®-Owren-Koller, далее смешивает с STA®-ImmunoDef XII. Затем полученная смесь инкубируется в кювете анализатора при температуре 37°C для инициации каскада свертывания по внутреннему пути. Анализатор регистрирует время до образования фибринового сгустка оптическим методом. Удлинение этого времени свидетельствует о низкой активности фактора XII в исследуемом образце. Для количественного выражения результата используется калибровочная кривая, построенная с помощью референсной плазмы (STA®-Unicalibrator). Активность фактора XII выражается в процентах.

Для доказательства нормальности распределения данных использовали критерий Колмогорова – Смирнова. По t-критерию Стьюдента оценивалась значимость различия средних значений при уровне p<0,05.

Для моделирования воспалительного ответа, вызванного ЛПС, и оценки влияния на активность фактора Хагемана используют клеточные культуры (моноциты, макрофаги). Методика определения взаимодействия фактора Хагемана и ЛПС грамотрицательных бактерий (на примере E. coli 0111:B4) описана в научной публикации [11], которая включает несколько этапов. Отмечено, что для предотвращения спонтанной активации эксперимент необходимо проводить в пластиковых пробирках. На первом этапе проводят подготовку реакционной смеси: препараты ЛПС и очищенного предшественника фактора XII смешиваются в Трис-буферном физиологическом растворе (0,01М Трис, 0,14М NaCl, pH 7,4), объем 100мкл. Далее смесь инкубируют при температуре 37°С 20 мин для активации фактора Хагемана (XIIa) под воздействием ЛПС. После инкубации к смеси добавляют препараты кроличьего прекалликреина (1,25г в 100мкл) и инкубируют в течение 20 мин, с целью оценки способности активированного фактора XIIа превращать прекалликреин в активный калликреин. Ферментативную активность образовавшегося калликреина определяют с помощью хромогенного субстрата. Интенсивность окраски реакционной смеси измеряют при длине волны 253нм. Данная методика позволяет оценить способность ЛПС к инициации контактной системы свертывания крови.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ данных показал снижение уровня фактора свертывающей системы крови XII у больных острым бруцеллезом 50,6 ± 14,0 %, относительно значения группы контроля 95,3 ± 9,5 % (p<0,05).

В условиях индуцированного бруцеллами незавершенного фагоцитоза происходит массовое накопление возбудителя, лимфатические узлы становятся резервуарами бактерий. Это создает условия для последующего проникновения патогена в кровоток, вызывая генерализацию инфекции и запуская вторую фазу гематогенного распространения по всему организму [12, 13].

Липополисахарид бруцелл ингибирует активность фактора свертывающей системы крови (XII фактор), вследствие его прямого связывания (рисунок).

Взаимодействие ЛПС Brucella с фактором Хагемана.

Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования

Угнетение активности фактора Хагемана вследствие взаимодействия с липополисахаридом возбудителя бруцеллеза приводит к снижению коагуляционного потенциала системы гемостаза. Данный механизм препятствует развитию тромботических осложнений в условиях инфекционного процесса.

Результаты полученных данных соответствуют выводам научного исследования [14], в котором отмечено, что дефицит фактора Хагемана нарушает начальный этап каскада свертывания крови и приводит к снижению риска развития тромбообразования. Фактор свертывания крови XIIa, активирующий калликреин-кининовую систему, опосредованно влияет на формирование иммуновоспалительных процессов в эндотелии сосудов [14].

Липополисахариды способны инициировать активацию фактора XII, тем самым связывая патофизиологические механизмы воспаления с системой свертывания крови [11, 15]. В исследовании [11] отмечено, что жирные кислоты, входящие в состав липополисахарида, могут связывать фактор Хагемана и приводить к активации гемостатических реакций.

Структура липида А ЛПС Brucella вследствие гетерогенности в составе жирных кислот обладает низкой токсичностью, это препятствует его полноценному взаимодействию с Toll-подобным рецептором 4 (TLR4) и приводит к снижению интенсивности воспалительной реакции. Для сравнения, липид А энтеробактерий имеет «каноническую» структуру, что позволяет эффективно связываться с TLR4, вызывая системный воспалительный ответ [12].

Анализ проведенных исследований у больных острым бруцеллезом позволил предположить, что связывание липида А молекулы ЛПС бруцелл с фактором Хагемана ограничивает (сдерживает) внутренний путь коагуляции при сохранении баланса вторичного гемостаза.

Заключение

Впервые проведена оценка ключевого маркера внутреннего пути свертывания крови –XII при остром бруцеллезе, показано понижение его концентрации в плазме крови.

Патофизиологический механизм этого феномена обусловлен особенностью структуры липида А ЛПС бруцелл. Структурная гетерогенность ограничивают его способность активно вовлекать фактор Хагемана в гемостатический каскад, что снижает уровень воспалительных реакций.

Относительно длительное сохранение бруцелл в организме приводит к невыраженному (умеренному) воспалению и сопровождается гемостатическим балансом процесса свертывания крови, что свидетельствует о достаточной адаптивной реакции организма, препятствующей развитию тромботических осложнений. Выявленные особенности взаимодействия фактора Хагемана с ЛПС бруцелл позволили глубже понять механизмы адаптации организма к инфекционному процессу.