Рак вульвы встречается редко, составляя всего 4% гинекологических злокачественных новообразований. Наиболее распространенный подтип – плоскоклеточная карцинома, выявляется в более 76% случаев данного заболевания [1]. Рак вульвы долгое время считался болезнью женщин в постменопаузе, однако в последние годы средний возраст заболеваемости снизился, что может быть связано с увеличением случаев инфицирования ВПЧ во всем мире [2].

Принято считать, что основным механизмом прогрессии злокачественных опухолей эпителиального происхождения, большинство которых представлены карциномами, является эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) [3]. В результате ЭМП эпителиальные клетки утрачивают клеточную полярность и стабильную межклеточную адгезию, которая во многих случаях связана с угнетением экспрессии Е-кадгерина, и начинают приобретать особенности мезенхимального фенотипа с увеличением экспрессии N-кадгерина и виментина. Именно такое «переключение кадгеринов» обеспечивает миграционную активность и способность к инвазии раковых клеток в соседние ткани, что приводит к метастазированию и тем самым снижению общей выживаемости пациентов [4]. Регуляция продукции E-кадгерина тесно связана с экспрессией Desmocollin 3. Desmocollin 3 (DSC3) представляет собой белок трансмембранной адгезии десмосом, который участвует в канцерогенезе при различных типах рака. Сверхэкспрессия DSC3 снижает пролиферацию клеток, способность к образованию колоний, вызывает остановку клеточного цикла G0/G1 и способствует апоптозу [5]. Увеличение экспрессии данного белка значительно ингибирует активность пути Akt и увеличивает экспрессию E-кадгерина. Напротив, снижение экспрессии Desmocollin 3 тесно связано с агрессивным течением заболевания и плохим прогнозом [6]. В последнее время выполнено достаточно много публикаций о прогностической роли белков Е-кадгерина, N-кадгерина и Desmocollin 3 при таких локализациях, как колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы. Однако исследования, в которых бы рассматривались маркеры ЭМП при раке вульвы, единичны. Поэтому целью нашей работы стало выявление особенностей экспрессии маркеров Е-кадгерина, N-кадгерина и Desmocollin 3 при раке вульвы и рассмотрение их в качестве прогностических факторов.

Материалы и методы исследования. В исследование были включены по 25 больных в возрасте от 29 до 80 лет: I группа – рак вульвы T1-2N0-M0 (G2) без метастазов; II группа – рак вульвы T1-2N1-M0 (G2) с метастазами в паховые лимфоузлы. Пациентки проходили плановое лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России в 2015-2020 гг. и подписывали информированное согласие на обработку персональных данных и передачу сведений, составляющих врачебную тайну на передачу биологического материала. Гистологически был верифицирован плоскоклеточный рак вульвы (n=50).

Морфологические исследования выполняли на базе патологоанатомического отделения ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (Ростов-на-Дону). Для фиксации материала использовали раствор 10%-ного нейтрального забуференного формалина с последующей стандартной проводкой. Далее приготавливали срезы толщиной 3-5 мкм. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Для ИГХ-исследования применяли протокол, опубликованный ранее [7]. Использовали моноклональные мышиные антитела к E-кадгерину (клон 12#, Cloud-Clone Corp.), к N-кадгерину (клон 389, Invitrogen, США) в разведении 1:300 и поликлональные к Desmocollin 3 (Invitrogen, США) в разведении 1:300. Для визуализации применяли систему детекции UltraVision Quanto Detection System HRP DAB. Экспрессия E- и N-кадгерина, а также Desmocollin 3 была полуколичественно проанализирована в соответствии с процентным соотношением клеток и интенсивностью окраски: 0 (0 -10%); 1+ (11 - 30%); 2+ (31 - 70%); 3+ (>70%). Экспрессия считалась положительной, если оценка была ≥2. Результаты иммуногистохимической реакции проводились с применением светового микроскопа AxioLab.A1 (Германия) при увеличении объектива х200, х400. Полученные данные обрабатывали методом статистической обработки с помощью пакета прикладных программ Statistica 13,0 (StatSoftInc., США). Изучаемые данные проверяли на соответствие нормальному распределению по критерию Шапиро-Уилка. В связи с тем что распределение оказалось далеко от нормального, сравнение групп проводилось с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (U-критерий) и критерия χ² Пирсона. Дополнительно оценивали относительный риск и статистическую значимость, исходя из значений 95%-ного доверительного интервала.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате исследования нами было выявлено, что максимальное окрашивание опухолевых клеток маркером E-кадгерин (90%) наблюдалось у пациенток без метастатического поражения, тогда как максимальная экспрессия N-кадгерина (45%) была отмечена у больных с поражением в лимфоузлы. Минимальные значения E-кадгерина (15%) были определены в опухолях пациенток основной группы, наименьшие значения N-кадгерина (1-2%) - у пациенток контрольной группы. Кроме того, нами было отмечено отсутствие экспрессии N-кадгерина в опухолях пациенток только контрольной группы у 36% (9). Процентный разброс опухолевых клеток, окрашенных E-кадгерином, у пациенток был достаточно большой как в контрольной группе, так и основной. При окрашивании N-кадгерином в опухолях пациенток исследуемых групп значительного разброса отмечено не было. Процентное содержание и медианы значений отображены в диаграммах размаха (рис. 1) и в таблицах 1 и 2.

Рис. 1. Диаграмма размаха уровня экспрессий E-кадгерина и N-кадгерина в опухолях вульвы у пациенток исследуемых групп

Таблица 1

Уровень экспрессии E-кадгерина в опухолях пациенток исследуемых групп

Примечание: * - отличия показателей статистически значимы между группами больных (p<0,05).

Таблица 2

Уровень экспрессии N-кадгерина в опухолях пациенток исследуемых групп

Данные, приведенные в таблице 1 и 2, демонстрируют, что наше исследование выявило наличие статистически значимых различий только экспрессии E-кадгерина в опухолях пациенток исследуемых групп. Значения экспрессии данного маркера преобладали в 2,3 раза в группе пациенток без метастатического поражения. Значения N-кадгерина, наоборот, превалировали в 2,9 раза в группе пациенток с метастатическим поражением, но без статистической значимости (p≥0,05).

На рисунке 2 представлены различные варианты экспрессии E-кадгерина и N-кадгерина у некоторых пациенток данного исследования.

Рис. 2. А и Б - экспрессия E-кадгерина в опухолевых клетках: А – больная Д. из основной группы (умеренная степень интенсивности - 2+). Х 400; Б – больная З. из контрольной группы (высокая степень интенсивности – 3+). Х 400. В и Г - экспрессия N-кадгерина в опухолевых клетках: В – больная Т. из контрольной группы (отсутствие экспрессии). Х 400; Г – больная Д. из основной группы (высокая степень интенсивности – 3+). Х 400

При анализе экспрессии белка Desmocollin 3 были получены следующие результаты. Максимальное окрашивание клеток маркером Desmocollin 3 (45%) наблюдалось в опухолях пациенток без метастатического поражения. Минимальное окрашивание (10%) нами было отмечено как в опухолях пациенток с метастазами, так и без метастазов. Процентный разброс окрашенных клеток в опухолях был незначительный также в обеих исследуемых группах (рис. 3, табл. 3).

Рис. 3. Диаграмма размаха уровня экспрессии Desmocollin 3 в опухолях вульвы у пациенток исследуемых групп

Таблица 3

Уровень экспрессии Desmocollin 3 в опухолях пациенток исследуемых групп

Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что наше исследование не выявило наличие статистически значимых различий экспрессии Desmocollin 3 в опухолях пациенток исследуемых групп. Значения экспрессии Desmocollin 3 хоть и преобладали в опухолях пациенток без метастатического поражения в 1,8 раза, однако статистической значимости отметить не удалось (p≥0,05).

На рисунке 4 представлены различные варианты экспрессии Desmocollin 3 у некоторых пациенток данного исследования.

Рис. 4. Экспрессия Desmocollin 3 в опухолевых клетках: А – больная К. из основной группы (низкая степень интенсивности - 1+). Х 400; Б – больная З. из контрольной группы (высокая степень интенсивности – 3+). Х 400

Помимо вышеизложенного, нами была проведена статистическая обработка результатов для оценки экспрессии исследуемых маркеров как факторов риска метастазирования при раке вульвы. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4

Распределение числа пациенток с положительной и отрицательной экспрессией исследуемых маркеров в опухолях вульвы изучаемых групп

Примечание: * - статистически значимые отличия между группами основная и контрольная (p≥0,05).

В результате статистического анализа (табл. 4) были определены χ2 Пирсона и относительные риски (RR) наличия положительного или отрицательного статуса исследуемых маркеров (E- и N-кадгерина, Desmocollin 3) в опухоли пациенток с раком вульвы. В результате было выявлено, что в группе с метастатическим поражением преобладали пациентки с положительным статусом N-кадгерин, тогда как в группе без метастатического поражения преобладали пациентки с положительным статусом E-кадгерин и Desmocollin 3. Количество пациенток с N-кадгерин+ было выше в 2,7 раза, E-кадгерин+ - в 2,9 раза, Desmocollin 3+ - в 2,4 раза. Все различия имели статистическую значимость (p≥0,05).

Итак, наше исследование выявило ряд особенностей в экспрессии маркеров эпителиально-мезенхимального перехода при раке вульвы. Отличительной чертой данного перехода является активация N-кадгерина с одновременным подавлением экспрессии E-кадгерина, которые регулируются сложной сетью сигнальных путей и факторов транскрипции. Потеря E-кадгерина в раковых клетках приводит к метастатическому распространению за счет высокой адгезии к внеклеточному матриксу и более высокой инвазивности. Данный факт был подтвержден и в нашем исследовании на материале рака вульвы. Вышеописанные результаты совпали с большинством исследований, проведенных при других злокачественных образованиях. Так, например, в работе Rosso M. было показано, что линии клеток рака яичников с более высокой экспрессией E-кадгерина показали меньшую устойчивость к гибели, более низкую адгезию к внеклеточному матриксу и более слабую инвазивность по сравнению с клеточными линиями с высокой экспрессией N-кадгерина [8]. Аналогичные данные были получены и в эксперименте на мышах с применением экзосом. Yang S.S. с соавторами показали, что в моделях с экзосомами РМЖ снижение экспрессии E-кадгерина и повышение экспрессии N-кадгерина усиливало инвазию рака молочной железы и способствовало образованию метастазов в легкие [9]. В исследованиях Мнихович М.В. с соавторами отмечалось, что при РМЖ снижение экспрессии E-кадгерина значительно чаще выявлялось у пациенток с метастазами в печень, развившимися в разные сроки [10].

Помимо вышеизложенного, снижение экспрессии белка Е-кадгерина является одним из прогностических факторов при светлоклеточном раке почки [11], колоректальном раке [12], раке простаты [13] и др.

Наряду с изменениями экспрессии N-кадгерина, регуляция E-кадгерина тесно связана с экспрессией белка Desmocollin 3. В работе T.Cui с соавторами показано, что Desmocollin 3 подавляет рост опухолевых клеток при колоректальном раке посредством ингибирования пути Akt и регуляции E-кадгерина, поэтому снижение его экспрессии связано с более высокой степенью злокачественности, метастазированием и более неблагоприятным прогнозом [14]. В нашем исследовании данный результат также был подтвержден, хотя и без статистической значимости.

Выводы. Таким образом, проведенное иммуногистохимическое исследование выявило особенности экспрессии маркеров Е-кадгерина, N-кадгерина и Desmocollin 3 при раке вульвы с разной распространенностью. Статистически значимые различия в экспрессии Е-кадгерина однозначно дают возможность предложить данный маркер как фактор прогноза метастазирования, тогда как для оценки прогностической значимости маркеров N-кадгерина и Desmocollin 3 необходимо более расширенное исследование.