Цитомегаловирус (ЦМВ) – оболочечный ДНК-содержащий вирус, самый крупный из герпесвирусов, подсемейства β-herpesviridae. У людей с иммуносупрессией способен вызывать широкий спектр клинических проявлений, от бессимптомной инфекции до тяжелого течения, нередко приводящего к смертельному исходу заболевания [1, 2]. После первичного заражения иммунокомпетентного хозяина запускается реализация как врожденного, так и приобретенного иммунитета, механизмы которого блокируют репликацию ЦМВ. Однако ввиду вирусной эвазии геном ЦМВ сохраняется в виде эписомы в ядрах клеток хозяина, что приводит к бессимптомной, пожизненной инфекции, которая сохраняется в виде латентной формы [3, 4, 5].

Наиболее высокую активность цитомегаловирус проявляет у людей с иммунодефицитными состояниями: беременных женщин, новорожденных, пожилых людей, реципиентов трансплантатов. У больных СПИДом, реципиентов солидных органов и гемопоэтических стволовых клеток ЦМВ-инфекция (ЦМВИ) способна принимать генерализованную форму, что является одной из ведущих причин смертности [6, 7]. По данным Всемирной организации здравоохранения, инфицированность населения ЦМВ в социально-экономически развитых составляет более 80% [4, 8]. Доля серопозитивных лиц среди взрослого населения в РФ составляет 73–98% [7].

ЦМВ способен инфицировать широкий спектр клеток человека, различающихся как по строению, так и по своим функциям. Во время литической инфекции экспрессируются все классы вирусных генов, реплицируется вирусная ДНК и образуются новые инфекционные вирусные частицы [9, 10]. Благодаря методу определения первичной структуры молекул секвенирование РНК (RNA sequencing, RNA-seq) инфицированных ЦМВ клеток известно, что во время латентного периода экспрессия вирусных генов гораздо активнее, чем предполагалось ранее. Например, к таким генам относится вирусный гомолог интерлейкина 10 (IL-10). В ряде исследований РНК этого гена была идентифицирована в латентной фазе ЦМВИ [11, 12, 13]. В его функции входит индукция активации IL-10 в моноцитах, макрофагах и дендритных клетках (ДК) [14, 15].

Посредством моноцитов и ДК вирус распространяется по организму хозяина, повреждая нейроны, фибробласты, эндотелиальные клетки, при этом приобретая персистирующий, хронический характер [16]. За сдерживание репликации и реактивации ЦМВ отвечает главным образом цитотоксический Т-клеточный иммунитет [17]. Во время литической фазы инфекции антигены ЦМВ могут изменить соотношение CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов путем изменения продукции ими ИЛ-4 и ИФН-γ, стимулируя развитие пула Т-клеток памяти, что способствует развитию аутоиммунитета [18, 19].

Как известно, ВИЧ вызывает истощение клеток: CD8+ Т-клетки теряют способность продуцировать противовирусные цитокины, убивать инфицированные клетки и пролиферировать в ответ на стимуляцию антигеном. Точно так же CD4 + T-клетки демонстрируют нарушение продукции цитокинов и снижение способности к пролиферации, повышается восприимчивость организма к оппортунистическим инфекциям. ВИЧ-инфекция характеризуется высоким уровнем репликации вируса, истощением CD4+ и CD8+ Т-клеток [6, 20]. Когда число CD4+ Т-лимфоцитов падает ниже 50–100 клеток/мкл, происходит реактивация вируса, вирионы высвобождаются в кровь и другие жидкости организма, что приводит к появлению симптомов острой ЦМВИ [21, 22].

Инфекции, вызванные ВИЧ и ЦМВ, сопряжены не только с нарушением адаптивного иммунитета, но и с дисфункцией врожденного иммунитета, а именно с нарушением функции ДК, моноцитов, макрофагов и выработки цитокинов.

В литературе представлены неоднозначные данные об изменении уровня ИФН-γ при развитии ЦМВИ и имеется небольшое количество публикаций на тему участия в иммунном ответе на ЦМВ важных противовирусных цитокинов ИЛ-29 (ИФН-λ1), ИЛ-28В (ИФН-λ3). Исходя из этого, требуется более глубокое изучение роли цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-29, ИЛ-28В, ФНО-α, ИЛ-10) в патогенезе развития ЦМВ-ассоциированных заболеваний на фоне иммуносупрессии, вызванной ВИЧ.

Цель исследования: охарактеризовать содержание ИФН-γ, ИЛ-29 (ИФН-λ1), ИЛ-28В (ИФН-λ3) ФНО-α и ИЛ-10 в сыворотке крови больных ВИЧ-инфекцией с ЦМВИ или без нее.

Материалы и методы исследования

Для выполнения поставленных задач были проведены динамическое наблюдение и обследование 142 пациентов мужского пола с ВИЧ (4а стадия). Пациенты ретроспективно были разделены на 2 группы. Группа I – 79 пациентов с ВИЧ, группа II – 63 пациента с ВИЧ и ЦМВ (средний возраст пациентов от 21 до 40 лет); 30 сопоставимых по полу и возрасту практически здоровых мужчин составили контрольную группу (ГК). Клинические и лабораторные данные пациентов получены на клинической базе ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (ректор д.м.н., проф. В.Б.Шуматов) – ГБУЗ «Краевая клиническая больница № 2» г. Владивостока (глав. врач, д.м.н., проф. С.Н. Бениова) за период с 2016 по 2021 гг. Иммунологические исследования выполнялись в научно-исследовательской лаборатории кафедры нормальной и патологической физиологии ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (зав. кафедрой д.м.н., проф. Е.В. Маркелова) и Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (зав. лабораторией д.б.н., доцент Н.Г. Плехова). ЦМВИ и ВИЧ-инфекция были диагностированы согласно Клиническим рекомендациям (утверждены решением Пленума правления Национального научного общества инфекционистов 30 октября 2014 г.). Определение уровней ИФН-γ, ИЛ-10, ИЛ-29, ИЛ-28В, ФНО-α в сыворотке венозной крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Наличие активной ЦМВ инфекции подтверждалось выявлением ДНК вируса полимеразной цепной реакцией (ПЦР), антител классов IgG и IgM в сыворотке крови, а также определением индекса авидности антител IgG при помощи ИФА. Группу контроля составили 30 практически здоровых добровольцев.

Первоначальная обработка данных проводилась с использованием Microsoft Excel с целью формирования базы данных, подготовки таблиц, расчета параметров непараметрической статистики (медианы, нижний и верхний квартиль).

На основе современных рекомендаций в отношении обработки данных была произведена проверка на нормальность распределения с использованием критериев Колмогорова–Смирнова в модификации Лиллиефорса и критерия Шапиро–Уилка. На основании результатов, полученных с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics v.25, нами был сделана вывод о ненормальности распределения полученных данных, что было подтверждено путем построения гистограммы распределения. Согласно рекомендациям по статистическому анализу, данные были представлены с использованием медианы (Me), верхнего (Q75) и нижнего (Q25) квартиля, а статистическая достоверность между сравниваемыми группами оценивалась при помощи U-критерий Уилкоксона–Манна–Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате исследований и анализа данных получены факты, подтверждающие глубокие нарушения в системе интерферонов при одновременной активации ФНО-α и ИЛ-10 у пациентов обеих групп (таблицы 1,2).

Таблица 1

Уровень интерферонов в сыворотке крови пациентов с ВИЧ-инфекцией

Обозначения: статистическая достоверность различий с группой контроля – p <0,001 – *

В группах пациентов с ВИЧ-инфекцией, как с ЦМВ, так и без него, значения ИФН-γ, ИЛ-29 (ИФН-λ1) и ИЛ-28В (ИФН-λ3) были снижены в 3–10 раз по сравнению с контрольной группой. При сравнении значений показателя ИФН-γ между группами были выявлены более высокие значения данного цитокина в группе пациентов с ЦМВ. При анализе уровня ИЛ-29 (ИФН-λ1) по группам была зафиксирована аналогичная картина.

ИФН-γ является важным звеном в клеточно-опосредованном иммунитете, в основном является провоспалительным цитокином [23]. Этот интерферон секретируется преимущественно CD4+ Тh-1 и естественными клетками-киллерами (NK-клетками), в последующем оказывая прямое ингибирующее действие на репликацию вирусов [24, 25]. Полученные данные, вероятно, свидетельствуют в пользу мнения об избыточной активации NK клеток, в том числе через Тh-1 опосредованный путь при ЦМВ-инфекции, нежели в ее отсутствие. Таким образом, при коинфекции ВИЧ и ЦМВ, несмотря на дефицит ИФН-γ, зарегистрировано относительно меньшее его снижение по сравнению с группой ВИЧ без ЦМВ. Вероятно, это связано с действием ИФН-λ1, уровень которого во II группе в среднем в 2 раза выше, чем в I группе. В исследовании, где рассматривалась роль NK-клеток во врожденном иммунитете, было показано, что ИФН-λ1 воздействовал на NK-клетки опосредованно через активацию макрофагов. Макрофаги, активированные ИФН-λ1, продуцировали цитокины семейства ИЛ-12, которые затем могли активировать NK-клетки, что приводило к увеличению продукции ИФН-γ [26, 27].

Семейство интерферона (IFN)-λ-цитокинов типа III включает близкородственные интерлейкины ИЛ-28A (ИФН-λ2), ИЛ-28B (ИФН-λ3) и ИЛ-29 (ИФН-λ1). Они продуцируются разными типами клеток, особо массово дендритными клетками, после вирусной инфекции или активации бактериальными компонентами. Интерфероны III типа проявляют противовирусную и цитостатическую активность, подобную интерферону I типа. В отличие от интерферонов типа I, популяции клеток-мишеней ИЛ-28/ИЛ-29 ограничены и в основном включают эпителиальные клетки и гепатоциты. Эти свойства предполагают, что ИЛ-28/ИЛ-29 являются потенциальными терапевтическими альтернативами интерферонам типа I в отношении вирусных инфекций [28].

Интерлейкин-29 (ИЛ-29, ИФН-λ1) является недавно обнаруженным членом семейства, представителем группы интерферонов III типа [29]. Он опосредует трансдукцию сигнала путем связывания со своим рецепторным комплексом и активирует нисходящие сигнальные пути, следовательно, индуцирует активацию провоспалительных механизмов [30]. В ходе нашего исследования было выявлено снижение уровня ИЛ-29 в I и II группах по сравнению с контрольной группой. Так как ВИЧ обладает сходным с вирусом гепатита С (ВГС) механизмом уклонения от иммунного ответа и иммуносупрессией, то можно предположить схожесть механизмов изменения ИЛ-29 с таковыми при ВГС. В исследовании M. Boisvert, N. H. Shoukry (2016) приводился следующий механизм: ВГС активирует экспрессию ИЛ-29, ИЛ-8 и ЦОГ-2. ИЛ-29 ингибирует репликацию ВГС, но в то же время ИЛ-8 ослабляет экспрессию ИЛ-10R2 и активность ИЛ-29 против ВГС, что способствует установлению персистирующей вирусной инфекции. Кроме того, ЦОГ-2 снижает выработку ИЛ-8, что, в свою очередь, ослабляет экспрессию ИЛ-29. В этом же исследовании представлены изменения уровня ИЛ-29 во время иммунного ответа при ВГС. Во время хронической инфекции ВГС уровни ИФН-λ1 в сыворотке были ниже по сравнению с контролем. Это объясняется тем, что белки вируса (HCV E2 и NS3) способны ингибировать продукцию ИФН-λ1 стимулированными дендритными клетками [26].

Можно предположить аналогичные механизмы изменений уровня ИЛ-29 при конфекции ВИЧ+ЦМВ во II группе по сравнению с I группой (ВИЧ). Однако этот вопрос требует дополнительных исследований, так как подобных работ в доступной литературе найдено не было.

Интерлейкин 28B (ИФН-λ3, ИЛ-28B), представитель интерферонов типа III, также играет важную роль в противовирусном иммунитете. Выявлена роль ИЛ-28B как индуктора иммунитета типа I. Сверхэкспрессия ИЛ-28B способствует поляризации естественных клеток-киллеров, что приводит к дифференцировке Th1, увеличению числа NK1-клеток, которые продуцируют ИФН-γ. Этот механизм реализуется как защитно-компенсаторный, в большей степени при ЦМВИ [31].

Продемонстрировано, что ИФН-λ3 может ингибировать репликацию вируса через путь JAK-STAT, приводя к экспрессии ISG способом, аналогичным с ИФН I типа [30]. ИЛ-28B действует как основной регулятор ответа В- и Т-клеток, повышая уровень цитокинов Th1 и подавляя цитокины Th2 [32].

В результате проведенного нами исследования установлено, что уровень ИЛ-28B был снижен в обеих группах по сравнению с группой контроля. Данных в литературе по изменению уровня ИЛ-28B и влиянию на исследуемые инфекции найдено не было. Предположительно, это может быть обусловлено генетическими факторами. Например, в исследовании M.H. Heidarian et al. (2021) была проанализирована корреляция между полиморфизмом IL-28 и спонтанным клиренсом у пациентов с ВГС. Результаты анализа показывают, что ИЛ-28B rs12979860 CC является сильным предиктором спонтанного клиренса инфекции гепатита С [33]. В исследовании I. Corrales, C. Solano, P. Amat, et al. (2016) было показано, что полиморфизм одного нуклеотида (SNP), расположенного рядом с геном ИЛ28B (rs12979860; C/T), влияет на динамику репликации ЦМВ путем ЦМВ-специфического Т-клеточного иммунитета [34]. Важным является дальнейшее изучение данного интерлейкина, так как он обладает значительной анти-ВИЧ активностью [35].

В результате проведенных нами исследований и анализа данных получены факты, подтверждающие одновременную активацию ФНО-α и ИЛ-10 у пациентов обеих групп при ВИЧ-инфекции (табл. 2).

Таблица 2

Соотношение провоспалительных и противовоспалительных цитокинов: ФНО-α/ ИЛ-10 – в сыворотке крови пациентов с ВИЧ-инфекцией

Обозначения: статистическая достоверность различий с группой контроля – p <0,001 – *

Уровень ФНО-α и ИЛ-10 достоверно повышен у пациентов I и II групп по сравнению с группой контроля. При сравнении значений между группами выявлено повышение уровня ФНО-α в I группе (р<0,05).

Фактор некроза опухоли α (ФНО-α) является ключевым провоспалительным цитокином в системе защиты хозяина от инфекционных заболеваний [36]. В результате исследования было зафиксировано повышение уровня ФНО-α в обеих группах по сравнению с группой контроля (табл/ 3). Синтез и секреция ФНО-α инфицированными CD4+ Т-лимфоцитами, моноцитами и макрофагами повышаются по мере прогрессирования ВИЧ-инфекции. Показано, что ФНО-α способен индуцировать белки вируса [37, 38].

При развитии ЦМВИ также активно вырабатывается ФНО-α, вирус индуцирует его продукцию в моноцитах и макрофагах. ФНО-α, в свою очередь, стимулирует активность транскрипции сверхранних белков ЦМВ (CMV-IE) [6].

При развитии ЦМВ повышается уровень ФНО-α, что вызывает активизацию дендритных клеток, их мобилизацию из кровяного русла. Следовательно, ФНО-α активирует сосудорасширяющие медиаторы, молекулы адгезии и хемокины, изменяя соединительную организацию эндотелиальных клеток, тем самым облегчая трансэндотелиальную миграцию иммунных клеток, включая ДК. Об этом свидетельствуют результаты исследований крови пациентов с ЦМВ-мононуклеозом [39]. Показано также, что повышенные концентрации ФНО-α свидетельствуют о реактивации латентной ЦМВ-инфекции [29].

ИЛ-10 считается главным отрицательным регулятором воспаления, уменьшает повреждение, вызванное провоспалительными цитокинами. Как показывает экспрессия его специфического рецептора (ИЛ-10R1), спектр клеточных мишеней ИЛ-10 включает практически все лейкоциты. Для устранения внутриклеточных патогенов, таких как вирусы, иммунная система обычно использует цитотоксические CD8+. CD8+ Т-лимфоциты, распознавая вирусные пептидные структуры, представленные на молекулах MHC 1-го типа, способны оказывать цитотоксическое действие в отношении инфицированных клеток. Тh-1 лимфоциты, в свою очередь, оказывают содействие в реализации цитотоксического ответа. Оба этих процесса, по данным литературы, могут модулироваться ИЛ-10 на различных этапах реализации иммунного ответа. При повышении уровня ИЛ-10 с целью разрешения острой фазы воспаления происходит негативная регуляция уровня Т-клеток [15, 40, 41].

В результате исследования был выявлен более высокий уровень ИЛ-10 в I и II группах по сравнению с КГ (табл. 3). Есть несколько исследований, объясняющих полученный нами результат [42, 43, 44].

Таблица 3

Уровень исследуемых цитокинов в сыворотке крови пациентов с ВИЧ-инфекцией

Обозначения: статистическая достоверность различий с группой контроля – p <0,001 – *

На фоне пролонгированной виремии при ВИЧ-инфекции происходит истощение пула Т-лимфоцитов и, как следствие, повышение сывороточных уровней ИЛ-10, что модулирует клеточный иммунный ответ, повышая толерантность Т-клеток в отношении вирусных антигентов, как следствие, пролонгируется персистенция инфекции. Кроме того, вирус продуцирует вирусные гомологи ИЛ-10, которые способствуют противовоспалительным реакциям [45].

Исследования персистирующей инфекции ЦМВИ помогли выяснить механизмы, с помощью которых ИЛ-10 может способствовать персистенции инфекции. В исследовании I. Corrales, C. Solano, P. Amat, et al. (2017) мышей заразили штаммом Armstrong (Arm) LCMV. Было документально подтверждено, что продукция ИЛ-10 была сильно повышена. При нейтрализации ИЛ-10 путем обработки антителами против ИЛ-10R ответы Т-клеток восстанавливались, и происходила элиминация вируса. При аналогичном изучении течения ВИЧ были получены схожие результаты. Таким образом, ИЛ-10 индуцирует иммуносупрессию, что приводит к персистенции вируса [43, 46].

При ЦМВИ ИЛ-10, кодируемый цитомегаловирусом (cmvIL-10), и ИЛ-10, кодируемый цитомегаловирусом, ассоциированным с латентностью (LAcmvIL-10), продуцируются в миелоидных клетках, что нарушает функцию последних. СmvIL-10 индуцирует продукцию hIL-10 в ДК, макрофагах и моноцитах, нарушает дифференцировку ДК и способствует М2-поляризации макрофагов. LAcmvIL-10 также индуцирует выработку hIL-10 в ДК и моноцитах и снижает способность моноцитов к представлению антигена [7]. Это ограничивает ответ Т-клеток против ЦМВ и способствует повышенной выработке ИЛ-10 [25, 43, 44].

В группах пациентов с ВИЧ-инфекцией, как с ЦМВИ, так и без нее, значения коэффициента ФНО-α/ИЛ-10 повышены по сравнению референсными значениями. При анализе этого показателя между группами были выявлены более высокие значения коэффициента ФНО-α/ ИЛ-10 в группе пациентов с ЦМВИ.

Таким образом, в нашем исследовании ФНО-α и ИЛ-10 были выявлены их одновременная активация и повышение значений коэффициента ФНО-α/ИЛ-10 по сравнению с группой контроля. В группе с коинфекцией ВИЧ и ЦМВ значения оказались выше, чем в группе с ВИЧ. Это демонстрирует превалирование провоспалительных механизмов при коинфекции ВИЧ и ЦМВ.

Зарегистрированные изменения в уровне интерферонов ИФН-γ, ИЛ-29, ИЛ-28В, ФНО-α, ИЛ-10 у пациентов с ВИЧ и ЦМВИ свидетельствуют о сложной картине взаимного влияния вирусов и врожденного иммунитета, отличающегося определенными закономерностями при наличии или отсутствии ЦМВИ. Углубленное изучение аспектов вирус-ассоциированного изменения интерфероновой регуляции в частности и врожденного иммунитета в целом способно расширить понимание взаимодействия между организмом человека, ВИЧ и его сопутствующей инфекцией.