Пуриновый обмен – совокупность процессов синтеза и катаболизма пуриновых нуклеотидов (АТФ и др.), нуклеозидов (аденозина, гуанозина и др.) и оснований (аденина, гуанина, ксантина). Конечным продуктом метаболизма пуринов является мочевая кислота (2,6,8-триоксипурин). Эти вещества участвуют в основных анаболических процессах, обеспечивающих жизнедеятельность организма, в том числе в передаче и хранении генетической информации, делении клеток. Пурины не только являются основными компонентами нуклеотидов, но и обеспечивают клетки необходимой энергией для пролиферации и выживания. Как следствие, пурины и их производные широко участвуют в различных биологических процессах, включая иммунные ответы и взаимодействие «хозяин – опухоль» [1], а нарушение их обмена связано с прогрессированием рака [2]. Известно, что под влиянием ишемии содержание пуринов в организме изменяется [3–6]. Следовательно, изучать пурины можно, с одной стороны, в качестве индикатора ишемии и окислительного стресса в тканях, с другой – в качестве индикатора повреждения генетического материала клеток и нарушения способности их к делению.

Почечно-клеточная карцинома – одно из наиболее распространенных злокачественных новообразований органов мочеполовой системы, диагностируемое, как правило, на ранней (локализованной) стадии развития опухолевого процесса. Оптимальным методом лечения локализованного почечно-клеточного рака является традиционная или роботизированная лапароскопическая частичная нефрэктомия, которая обеспечивает не только равные с радикальной нефрэктомией онкологические исходы, но и, в отличие от нее, лучшее сохранение функции почек [7–9]. Вместе с тем на фоне удовлетворительных онкологических результатов резекции почки по поводу локализованного рака ишемия-реперфузия, которая сопровождает выполнение таких операций, провоцирует риск развития острой почечной недостаточности, особенно у пациентов с хронической болезнью почек [10].

Когда доставка кислорода нарушается или снижается, в организме развиваются многочисленные адаптивные механизмы, способствующие выживанию клеток в гипоксическом состоянии. Обычно такая гипоксическая реакция прекращается, когда уровень кислорода восстанавливается. Ситуация осложняется, если сохраняется стресс, связанный с ишемией [11].

Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей пуринового метаболизма в корковом веществе почек у молодых самцов крыс в зависимости от продолжительности ишемии одной из них.

Материал и методы исследования

Была изучена динамика пуринов в корковом веществе обеих почек у молодых самцов (n=50): ишемизированной (правой) и контрлатеральной (левой) – после ишемии одной из них в течение 5, 10, 15, 20 и 25 мин. Исследование проводилось на модели «две почки, один зажим». Наркотизированные животные размещались в положении «на спине». Шерсть на животе удаляли, операционное поле обрабатывали антисептиком. Разрез проводили вдоль белой линии живота от мечевидного отростка грудины до лобка, рассекали кожу и соединительную ткань. Выделяли сосудистую ножку правой почки, которую затем клипировали зажимом Холстеда. Рану на протяжении периода ишемии прикрывали салфеткой, смоченной стерильным физраствором. Через определенные промежутки времени (5, 10, 15, 20 и 25 мин) крыс декапитировали на гильотине, не выводя из наркоза и не снимая зажима с почечной ножки. В качестве контроля исследовали молодых самцов без ишемии (n=10).

Работа с животными осуществлялась в соответствии с правилами «Европейской конвенции о защите животных, используемых в экспериментах» (Директива 86/609/ЕЕС) и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование было одобрено биоэтическим комитетом по работе с животными ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, протокол № 3/11 от 26.11.2014 г.

У животных исследовали обе почки, которые разделяли послойно на корковую и мозговую составляющие, и определяли их вес. 100 мг ткани коркового вещества промывали 1хфосфатно-солевым буфером (PBS), гомогенизировали в 1 мл 1хPBS и оставляли на ночь при –20°C. Для полного разрушения клеточных мембран проводили два цикла замораживания-оттаивания. Полученную суспензию центрифугировали 5 мин при 5000 g (2–8°C). Супернатант отбирали, делили на аликвоты и хранили при –20°C. Перед измерением размороженные образцы центрифугировали. В тканях определяли пурины: аденин, гуанин, ксантин, гипоксантин и мочевую кислоту – методом прямой спектрофотометрии в водном растворе термокоагулянта лизатов клеток почек по методике Е.В. Орешникова и др. (2008).

Ксантиноксидаза является ключевым ферментом окисления пуринов. Из данных литературы известно, что у млекопитающих фермент ксантиноксидоредуктаза в нормальных условиях находится преимущественно в ксантидегидрогеназной форме. При ишемии органов наблюдается быстрая (в течение нескольких минут) трансформация ксантандегидрогеназы в ксантиноксидазу. Такой же быстрый переход фермента в оксидазную форму наблюдается при гомогенизации тканей, что существенно затрудняет определение истинного соотношения разных изоформ фермента in vivo [12]. Все вышесказанное обусловило наш подход к анализу эффективности работы ксантиноксидазы – по вычислению соотношения конечного продукта фермента к его исходному субстрату. На 1-м этапе своей работы ксантиноксидаза превращает гипоксантин в ксантин (субстрат – гипоксантин, продукт – ксантин), на 2-м этапе ксантиноксидаза превращает ксантин в мочевую кислоту (субстрат – ксантин, продукт – мочевая кислота), и, когда мы в целом характеризуем работу фермента, в качестве субстрата выступает гипоксантин, в качестве конечного продукта – мочевая кислота.

Об интенсивности пуринового обмена судили, рассчитывая величину, представляющую собой отношение концентрации гипоксантина к количеству образующихся из него продуктов: ксантина и мочевой кислоты, и определяющую уровень необратимого катаболизма пуринов. Интенсивность пуринового обмена (ИПО) = гипоксантин/(ксантин + мочевая кислота). Также вычисляли показатель тяжести гипоксии – отношение концентраций (экстинций) ксантина к гуанину. Показатель тяжести гипоксии (ПТГ) = ксантин/гуанин [3].

Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи программы Statistica 10.0. Все результаты были проверены на соответствие закону о нормальном распределении (критерий Шапиро–Уилка). Для показателей с нормальным распределением использовали критерий Стьюдента, для показателей, распределение которых не соответствовало нормальному, – критерий Манна–Уитни. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартная ошибка среднего (М±m). Значимыми считали отличия при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В ишемизированной почке у молодых самцов через 5 мин ишемии содержание гипоксантина и аденина увеличивалось в 1,2 раза (р<0,05) (табл. 1). Через 10 мин во столько же раз увеличивалась концентрация гуанина и ксантина. На 15-й и 20-й минуте содержание всех пуринов становилось нормальным, а к 25-й минуте – уменьшалось: гуанина и гипоксантина – в 1,6 раза (р<0,05) относительно 5 мин ишемии; аденина и ксантина – в 1,5 раза (р<0,05) относительно интактной ткани (табл. 1). В контрлатеральной почке концентрация всех пуринов, кроме мочевой кислоты, возрастала через 15 мин ишемии: гуанина, гипоксантина, аденина – в 1,4 раза (р<0,05), ксантина – в 1,3 раза (р<0,05) (табл. 1). К 20-й минуте ишемии содержание гипоксантина, аденина и ксантина возвращалось к нормальным значениям. Через 25 мин ишемии концентрация всех пуринов уменьшалась: гуанина – в 1,6 раза (р<0,05) относительно 15-минутной ишемии, гипоксантина и аденина – в 1,7 раза (р<0,05) относительно 15-минутной ишемии и в 1,4 раза (р<0,05) относительно 5-минутной ишемии; уровень ксантина становился в 1,3 раза (р<0,05) ниже, чем в интактной почке; в 1,5 раза (р<0,05) уменьшалась концентрация мочевой кислоты (табл. 1).

Таблица 1

Динамика содержания пуринов (ед. экст./г ткани) в корковом веществе почек молодых самцов под влиянием ишемии

Примечание – статистически значимые отличия от: * – интактных крыс, 1 – 5 мин ишемии, 2 – 10 мин ишемии, 3 – 15 мин ишемии, 4 – 20 мин ишемии, п – левой (контрлатеральной) почки от правой (ишемизированной); Г – гуанин, ГК – гипоксантин, А – аденин, К – ксантин, МК – мочевая кислота

Следовательно, почки молодых самцов статистически значимо отличались друг от друга по уровню пуринов в их корковом веществе через 15 и 25 мин ишемии одной из почек. Так, через 15 мин ишемии в контрлатеральной почке содержание гуанина, гипоксантина и аденина было больше, чем в ишемизированной, в среднем в 1,25 раза (р<0,05), тогда как через 25 мин ишемии в контрлатеральной почке превалировал только аденин – в 1,26 раза (р<0,05) на фоне снижения концентрации пуринов в обеих почках (табл. 1).

В почке, подвергнутой ишемии, изменялись значения расчетных коэффициентов: через 10 мин ишемии на 16,5% уменьшалась скорость превращения ксантина в мочевую кислоту (2-й этап работы ксантиноксидазы), через 20 мин – на 3% (р<0,05) увеличивался показатель тяжести гипоксии, через 25 мин – на 11,7% (р<0,05) уменьшалась скорость образования ксантина из гипоксантина (1-й этап работы ксантиноксидазы) (табл. 2). В контрлатеральной почке через 15 мин ишемии на 6,8% уменьшалось значение показателя тяжести гипоксии (табл. 2). Через 25 мин на 13%, как и в ишемизированной почке, уменьшалась скорость образования ксантина из гипоксантина (1-й этап работы ксантиноксидазы) и на 20,3% увеличивалась интенсивность пуринового обмена (табл. 2).

Таблица 2

Динамика расчетных коэффициентов (отн. ед.) в корковом веществе почек молодых самцов под влиянием ишемии

Примечание – статистически значимые отличия от: * – интактных крыс, 1 – 5 мин ишемии, 2 – 10 мин ишемии, 3 – 15 мин ишемии, 4 – 20 мин ишемии; КО – ксантиноксидаза, ИПО – интенсивность пуринового обмена, ПТГ – показатель тяжести гипоксии

Ишемизированная почка статистически значимо отличалась от контрлатеральной только по величине одного показателя – тяжести гипоксии – через 15 и 20 мин ишемии. В контрлатеральной почке его величина была соответственно на 5,7% и 6,5% меньше, чем в ишемизированном органе (табл. 2).

Известно, что гипоксия индуцирует усиление трансформации ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу, с помощью которой осуществляется окисление с образованием супероксиданионрадикала. Усиление образования свободных радикалов в указанной системе обусловлено накоплением субстратов реакции – ксантина и гипоксантина [4].

Однако аденин и гуанин входят в состав нуклеотидов. Важнейшие их функции – хранение и передача генетической информации, участие в процессе деления клеток, биосинтезе белка, построении клеток. Пуриновые основания (аденин и гуанин) способны реутилизироваться, т.е. применяться повторно. В частности, аденин, соединяясь с рибозой, образует аденозин. Аденозин является предшественником АТФ – важного источника энергии клеток. Оказалось, что аденозин не только сохраняет клеточное содержание АТФ во время ишемии, но и оказывает цитопротекторное действие во время реоксигенации [13].

Следовательно, высокие или нормальные уровни аденина и гуанина в течение первых 20 мин ишемии свидетельствовали о достаточной сохранности коркового вещества обеих почек и способности их к восстановлению после прекращения действия повреждающего фактора: первые 10 мин – практически одинаковой сохранности обеих почек, с 15-й минуты – бóльшей сохранности контрлатеральной почки.

Уменьшение количества всех пуринов, кроме мочевой кислоты, в почках через 25 мин ишемии одной из них указывало на выраженное повреждение паренхимы, максимально – в ишемизированной почке. Известно, что ишемическое повреждение почек поражает клетки проксимальных канальцев, вызывая дисфункцию и гибель их клеток после тяжелой гипоперфузии [13]. Большее повреждение ишемизированной почки было обусловлено большей степенью гипоксии органа, развившейся через 20 мин после наложения зажима на сосудистую ножку почки, о чем свидетельствовало увеличение показателя тяжести гипоксии в ишемизированной почке именно через этот промежуток времени. Ранее нами было показано, что в корковом веществе ишемизированной почки у молодых самцов крыс через 20 мин ишемии максимально увеличивалось содержание L-FABP – маркера ОПП, который, как известно, быстро выходит из поврежденных тканей, и впервые возрастал уровень KIM-1 – еще одного маркера ОПП, увеличивающегося только при патологических состояниях почек [14].

Кроме того, изменение динамики пуринов в почках, возникающее под влиянием ишемии одной из них, нас интересовало не только с точки зрения выраженности постгипоксических изменений паренхимы почек, т.е. обратимости изменений нефронов и восстановления их функции, но и с точки зрения создания условий для гипотетически возможного рецидивирования злокачественной опухоли в почечной ткани. В практике онкоуролога тепловая ишемия почек применяется при резекции почек, т.е. на хирургическом этапе лечения рака почки. Однако ни один хирург не может дать гарантию, что в послеоперационной ране или в системном кровообращении не осталось пусть и единичных, но все еще жизнеспособных опухолевых клеток, которые могут дать начало опухолевому росту. При этом известно, что именно пуриновые нуклеотиды, с одной стороны, способствуют пролиферации опухолевых клеток [15], с другой – служат мощными модуляторами ответа иммунных клеток и высвобождения цитокинов через различные подтипы рецепторов, которые в значительной степени участвуют в развитии онкогенеза и туморогенеза [16]. Поэтому увеличение концентрации практически всех пуринов, кроме мочевой кислоты, через 10 мин ишемии в ишемизированной почке и через 15–20 мин ишемии в контрлатеральной почке могло свидетельствовать и о создании благоприятных условий для приживления опухолевых клеток в почечной ткани.

Заключение

Таким образом, установлено, что у молодых самцов обе почки «отвечают» практически одинаковой динамикой пуриновых метаболитов в корковом веществе на ишемию одной из них, при этом в ишемизированном органе изменения возникают раньше и в большей степени. При определенной продолжительности гипоксии (10 мин – в ишемизированной почке и 15–20 мин – в контрлатеральной почке) создаются благоприятные условия для приживления неопластических клеток в почечной ткани. Выявленные особенности метаболизма пуринов надо учитывать при проведении оперативных вмешательств на почках у людей.