Во всем мире в 2018 г. было диагностировано 2,1 млн новых случаев РМЖ [1]. В Кыргызстане за 2017 г. заболеваемость РМЖ составила 18,6 на 100 000 населения (по данным Национального центра онкологии и гематологии, г. Бишкек), при этом уже не первый год РМЖ является самой часто встречающейся опухолью у женщин. РМЖ является чрезвычайно гетерогенным заболеванием, заболеванием со значительным генетическим компонентом. Индивидуальная репарационная способность клетки (следовательно, предрасположенность к раку) определяется аллелями генов, кодирующих белки репарации. Обнаружение таких аллелей полиморфных вариантов генов в отдельных популяциях позволит выявлять группы высокого генетического риска, работа с которыми должна стать основой профилактики РМЖ. Так, популяционное исследование полиморфизмов генов репарации ДНК, проведенное в Польше, обнаружило, что аллели XRCC1-Gln (OR 6.37; 95% CI 4.86–8.35, p < .0001), hMSH2-Asp (OR 4,41; 95% CI 3,43–5,67, p < .0001), XPD-Gln (OR 2,56; 95% CI 2,02–3,25, p < .0001) and RAD51-T genes (OR 1,44; 95% CI 1,15–1,80, p=0,002) ассоциированы с повышенным риском развития РМЖ [2]. Другое исследование, включающее 362 пациента с наличием мутаций в гене Palb2, показало, что риск развития РМЖ у носителей мутаций Palb2 был в 8–9 раз выше по сравнению с общей популяцией среди пациентов моложе 40 лет, в 6–8 раз выше – среди пациентов 40–60 лет и в 5 раз выше – у пациентов старше 60 лет [3]. Исследование полиморфизмов генов XRCC1, MDM2, TP53 у женщин с РМЖ кыргызской популяции обнаружило аллели и генотипы, повышающие риск РМЖ более чем в 3 раза по сравнению с общей популяцией: аллель 399Gln (ОШ 1,57; 95% ДИ 1,05–2,35), генотип Arg399Gln гена XRCC1 (ОШ 2,77; 95% ДИ 1,60–4,80), сочетание гетерозиготных генотипов Arg399Gln/Arg72Pro генов XRCC1/TP53 (ОШ 3,98; 95% ДИ 1,57–10,09), Arg399Gln/T309G генов XRCC1/MDM2 (ОШ 3,0; 95% ДИ 1,18–7,56), Arg399Gln/Arg72Pro/T309G генов XRCC1/TP53/MDM2 (ОШ 6,40; 95% ДИ 1,18–34,63) [4]. Для составления целостной картины генетического полиморфизма РМЖ в кыргызской популяции необходимо также исследование других генов, ассоциированных с РМЖ. Так, наше исследование включает изучение полиморфизмов генов XRCC1, Palb2, HMMR, TNF-a. Ген XRCC1 (X-ray repair cross-complementing gene) является основным геном эксцизионной репарации оснований (base excision repair (BER) и репарации одноцепочечных разрывов ДНК (single-strand break repair (SSBR). Дефицит/мутации XRCC1 ассоциированы с развитием некоторых злокачественных опухолей, включая РМЖ. Более того, РМЖ с мутацией XRCC1 характеризуется агрессивным фенотипом, высоким риском рецидива, а также чувствительностью к ингибитору PARP1 (Poly [ADP-ribose] polymerase 1) – Олапарибу [5]. Ген Palb2 (partner and localizer of BRCA2) участвует в процессе репарации ДНК путем взаимодействия с геном BRCA2 (breast cancer 2). Ген HMMR (Hyaluronan Mediated Motility Receptor) относится к генам низкой пенетрантности. Повышение экспрессии HMMR в отдельных популяциях ассоциировано с высокой пролиферативной активностью и плохим прогнозом РМЖ [6]. Ген TNF-a (tumor necrosis factor a) кодирует ключевой провоспалительный цитокин, секретируемый макрофагами и играющий важную роль в развитии злокачественных опухолей [7].

Целью настоящего исследования является изучение роли генетических полиморфизмов p.Arg194Trp гена XRCC1, p.38444T>G гена Palb2, p.Val353Ala гена HMMR, p.aG308A гена TNF в развитии рака молочной железы в популяции кыргызских женщин.

Материал и методы исследования. Исследование проведено по типу случай-контроль и включает 201 женщину кыргызской этнической группы, из которых 99 женщин с морфологически верифицированным раком молочной железы (исследуемая группа) и 102 женщины без онкологической патологии (контрольная группа). Исследуемая группа включает пациентов, получавших стационарное лечение в Национальном центре онкологии и гематологии и в КафМедЦентре (г. Бишкек, Кыргызская Республика). Средний возраст обследуемой этнически однородной популяции составил 48 лет (24–74).

После разъяснительной беседы и добровольного согласия в письменной форме всех обследуемых пациентов сделан забор 5 мл венозной крови для проведения молекулярно-генетических исследований. ДНК выделяли стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции. Идентификацию генотипа в полиморфных локусах TNFα (rs1800629) HMMR (rs299290), PALB2 (rs45516100), XRCC1 (rs1799782) проводили методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Краткая характеристика исследованных однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) представлена в таблице 1.

Таблица 1

Краткая характеристика исследованных ОНП

Информация о последовательностях олигонуклеотидов для анализируемых ОНП, а также об используемой эндонуклеазе рестрикции представлена в таблице 2.

Таблица 2

Структура праймеров для амплификации фрагментов полиморфных локусов TP53, XRCC1, TNFα, HMMR, MDM2 и PALB2

Амплификацию исследованных полиморфных сайтов проводили в 20 мкл реакционной смеси. В состав реакционной смеси входили: SynTaq-полимераза (ООО «Синтол», РФ); 10x ПЦР-буфер (100 мМ Трис-HCl, 500 мМ KCl, 0,8% Nonidet P40, pH=8,8), 50 мМ раствор MgCl2 (финальная концентрация ионов Mg2+ – 3,0 мМ); 2,0 мМ раствор смеси дНТФ; смесь прямого и обратного праймеров в концентрации 5,0 мкМ.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы SPSS 16.0. Наличие связи между генотипом и клинико-морфологическими характеристиками определялось с использованием χ2 и с помощью построения четырехпольной таблицы. Для обнаружения ассоциации между генотипом и риском развития РМЖ рассчитывали отношение шансов с 95%-ным доверительным интервалом для каждого генотипа в отдельности и для всех возможных комбинаций генотипов. Статистическая значимость считалась достоверной при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Основные клинико-морфологические данные пациентов, включая возраст, наследственный анамнез, индекс массы тела (ИМТ), гистологические подтипы, степень дифференцировки и распределение по стадиям, представлены в таблице 3. Распределение по стадиям заболевания проводилось согласно классификации AJCC (American Joint Commmittee on Cancer, 2018) (табл. 3).

Таблица 3

Общая клинико-морфологическая характеристика обследованных пациентов с РМЖ

Ассоциации исследованных генотипов с клинико-морфологическими характеристиками обследованных пациентов

Возраст верификации диагноза. Средний возраст пациентов в нашем исследовании составил 48±9,8 года. Нами были обнаружены достоверные различия во встречаемости генотипов полиморфного локуса p.Arg194Trp (XRCC1) у женщин с разным возрастом верификации диагноза. А именно, средний возраст пациентов с аллелем 194Trp локуса p.Arg194Trp (XRCC1) составляет 51,8 года (95% ДИ 48–55), тогда как при генотипе Arg194Arg средний возраст составляет 46 лет (95% ДИ 44–49) (р=0,017). Таким образом, генотип Arg194Arg ассоциируется с ранним возрастом наступления РМЖ (до 50 лет), тогда как аллель 194Trp повышает риск развития РМЖ после 50 лет.

Менопауза. Средний возраст наступления менопаузы в нашем исследовании составил 43 года, при этом менопауза наблюдалась у 33 пациенток (33,3%). Нами были выявлены статистически значимые различия между распределением генотипов полиморфного локуса p.Arg194Trp (XRCC1) у пременопаузальных и постменопаузальных пациентов (p=0,005). Следовательно, у постменопаузальных пациентов генотип Arg/Arg встречается с частотой 52%, тогда как у пациентов до наступления менопаузы тот же генотип встречается с частотой 78,8% (p=0,009). Таким образом, генотип Arg194Arg достоверно значимо ассоциируется с развитием РМЖ у пременопаузальных пациентов (p=0,005). Следовательно, обнаружение генотипа Arg194Arg при молекулярно-генетическом тестировании пременопаузальных женщин является маркером повышенного риска развития РМЖ.

Индекс массы тела. Среднее значение индекса массы тела (ИМТ) в нашем исследовании составило 26,19 [19,3–32]. Расчет ИМТ проводился при поступлении больных в стационар и рассчитывался по следующей формуле: ВЕС (кг) / РОСТ ² (м).

Мы провели условное разделение пациентов на 2 группы:

1) группа с нормальным значением ИМТ (ИМТ=19–25): n=15;

2) группа с высоким значением (ИМТ>25): n=29.

Нами была обнаружена статистически значимая связь между частотой встречаемости генотипов полиморфного локуса Arg194Trp гена XRCC1 и значением ИМТ. Так, генотип Arg194Arg одинаково часто встречается у женщин с нормальным и высоким значением ИМТ, тогда как генотипы Arg/Trp//Trp/Trp достоверно чаще встречаются у женщин с высоким ИМТ (р=0,003) (табл. 4). Таким образом, обнаружение генотипов Arg/Trp//Trp/Trp p.Arg194Trp (XRCC1) у женщин кыргызской популяции с высоким значением индекса массы тела может повышать риск развития РМЖ.

Таблица 4

Распределение генотипов полиморфных сайтов p.Arg194Trp (XRCC1),

p.38444T>G (Palb2), p.Val353Ala (HMMR), g.4682G>A (TNFa) у больных РМЖ в зависимости от значения ИМТ и менопаузы

Для определения ассоциации исследованных генотипов с риском развития РМЖ мы рассчитали отношение шансов и 95%-ный доверительный интервал для каждого генотипа и всех возможных комбинаций генотипов. Исследование показало, что генотип CT полиморфного локуса p.Val353Ala (HMMR) является протективным и предупреждает развитие РМЖ в кыргызской популяции [ОШ=0,481, 95% ДИ 0,272–0,850, р=0,011]. Сочетания генотипов Arg/Trp//Trp/Trp (p.Arg194Trp (XRCC1)//СТ (p.Val353Ala (HMMR) (ОШ=0,385 [0,178–0,823], р=0,005), генотипов CT (p.Val353Ala (HMMR) //TT (p.38444T>G (Palb2) (ОШ=0,459 [0,259–0,814], р=0,007), генотипов CT (p.Val353Ala (HMMR)//GG (p.aG308A (TNFa) (ОШ=0,546 [0,298–0,999], р=0,048) также являются протективными факторами и ассоциированы с низким риском развития РМЖ в кыргызской популяции (табл. 5, 6).

Таблица 5

Расчет ОШ для генотипов полиморфных сайтов p.Arg194Trp (XRCC1), p.38444T>G (Palb2), p.Val353Ala (HMMR), g.4682G>A (TNFa)

Таблица 6

Расчет ОШ для комбинаций генотипов полиморфных сайтов p.Arg194Trp (XRCC1), p.38444T>G (Palb2), p.Val353Ala (HMMR), g.4682G>A (TNFa)

Заключение

Основные результаты проведенного исследования:

1. Гомозиготный генотип Arg194Arg полиморфизма p.Arg194Trp (XRCC1) ассоциирован с развитием РМЖ до 50 лет, а также у женщин в пременопаузе, тогда как наличие аллеля 194Trp повышает риск РМЖ после 50 лет.
2. Наличие генотипов Arg/Trp//Trp/Trp полиморфизма p.Arg194Trp (XRCC1) повышает риск РМЖ у женщин с высоким ИМТ (>25).
3. Генотип CT полиморфизма p.Val353Ala (HMMR) является протективным в отношении риска РМЖ, так же как сочетание генотипов Arg/Trp//Trp/Trp (p.Arg194Trp (XRCC1)//СТ (p.Val353Ala (HMMR), CT (p.Val353Ala (HMMR)//TT (p.38444T>G (Palb2), CT (p.Val353Ala (HMMR)//GG (p.aG308A (TNFa).