Рак пищевода считается одним из наиболее неблагоприятных по течению и прогнозам злокачественных новообразований. Данный вид опухоли является причиной высокой смертности больных и находится на 6-м месте в мире по этому показателю, невзирая на постоянно совершенствующиеся методы лечения и тенденцию к снижению уровня заболеваемости [1, 2].

Основными формами первичных новообразований пищевода являются плоскоклеточный рак (в России 89–92% из всех случаев) и аденокарцинома (7–10% соответственно). Однако в некоторых странах Западной Европы и США наблюдается возрастание доли аденокарциномы по сравнению с плоскоклеточным раком вплоть до преобладания заболеваемости первой из них [3].

В целом успехи в лечении рака пищевода признают незначительными, а прогноз – неблагоприятным [4]. В течение последних десятилетий наблюдается стойкая тенденция к ухудшению ситуации за счет снижения дифференцировки опухолей данной локализации и роста вовлеченности в злокачественный процесс регионарных лимфоузлов [5].

Вышесказанное определяет неоспоримую важность разработки новых и усовершенствования существующих методов профилактики и лечения злокачественных опухолей пищевода [6], а также изучения их патогенеза и биологии, в частности факторов, определяющих рост и прогрессию [7].

Для развития онкологии на современном этапе необходимо совершенствовать экспериментальную базу, и в решении этой задачи особая роль отводится доклиническим испытаниям на лабораторных животных [8, 9, 10]. В области исследований новых противоопухолевых препаратов перспективным является создание экспериментальных моделей – ксенографтов, которые представляют собой человеческий опухолевый материал, трансплантированный в организм животного. Такие модели более адекватно отражают особенности злокачественного процесса в донорском организме, что определяет целесообразность их использования в исследованиях на этапе доклинической разработки и тестирования новых фармакологических субстанций.

Целью работы стал обзор данных, связанных с созданием эктопических и ортотопических моделей наиболее часто встречающихся гистологических типов рака пищевода, а также пищевода Барретта – потенциального предшественника аденокарциномы, на лабораторных животных, особенностями моделирования метастазов и использованием получаемых объектов в доклинических исследованиях. Проанализированы отечественные и зарубежные литературные источники. Произведен поиск тематических статей в русскоязычных базах по следующим ключевым словам: рак пищевода, ортотопическая модель рака пищевода, ксеногенная опухолевая модель пищевода, ксенографт. В англоязычных базах проведен по запросам: xenograft, orthotopic tumor models, models of esophageal cancers, animal models of cancer.

Модели опухолей пищевода человека, полученные на животных

Основная цель разработки моделей ксенотрансплантатов опухолей заключается в том, чтобы объединить фундаментальные и клинические исследования и дополнить данные, полученные при использовании систем in vitro [11]. Получаемые на животных модели создают платформу для изучения процесса опухолевого генеза в условиях in vivo, которая позволит лучше понять участие некоторых онкогенов или опухолевых супрессоров в развитии опухоли, раскрыть их сигнальные пути и механизмы онкологических заболеваний [12]. Также использование таких моделей может предоставить исследовательский инструмент для доклинического тестирования лекарственных средств: определения противоопухолевой эффективности препарата, его фармакокинетики и фармакодинамики [13]. Кроме того, ксеногенные опухоли, полученные на различных анатомических сайтах лабораторных животных, могут служить экспериментальной базой для проверки эффективности существующих и разработки новых методов обнаружения, а также мониторинга роста и дифференцировки злокачественных новообразований.

Наиболее часто используемыми животными для получения опухолевых моделей являются лабораторные мыши из-за нескольких ключевых преимуществ, таких как: наличие сопоставимого с людьми размера генома, короткий репродуктивный цикл и многочисленное потомство, низкие затраты на содержание, простота их обслуживания и т.д. [12]. В интересующем нас исследовательском направлении используются различные линии иммунодефицитных мышей, к которым относятся атимичные голые мыши nude (дефектны по Т-клеточному звену иммунитета), мыши SCID (имеют более тяжелую форму иммунодефицита) и мыши NOD/SCID (характеризуются сочетанием дефектов иммунной системы и нарушением обмена веществ) [8, 12, 13]. Среди этих линий мыши NOD/SCID демонстрируют более выраженный иммунодефицит, связанный с отсутствием или дефектом почти во всех типах иммунных клеток (В-, Т-, дендритные клетки, макрофаги и NK-клетки) [14].

На сегодняшний день в современной экспериментальной онкологии наиболее часто исследовательские работы проводят на эктопических ксеногенных опухолях, в то время как ортотопические ксенографты используют достаточно редко. Эктопические модели получают в результате трансплантации человеческого опухолевого материала в сайты, не соответствующие донорскому органу, из которого злокачественные клетки были взяты. Наиболее распространенным вариантом эктопической ксенотрансплантации является введение опухолевого материала под кожу реципиента, что связано с его очевидными преимуществами: технической простотой процедуры и наблюдения за ростом полученной опухоли.

Несмотря на это, подкожная опухолевая модель имеет существенные недостатки, поскольку далеко не полностью отражает клиническую ситуацию. Например, она не обладает гетерогенностью донорской опухоли, так как в большинстве случаев в качестве исходного материала используются линейные злокачественные клетки. Кроме того, подкожные ксенографты, полученные из опухолевого материала эктопических сайтов, находятся в нетипичном для них микроокружении, что делает их непригодными для изучения опухоле-стромальных взаимодействий, а также практически не способными к инвазии и метастазированию. При таких сильных и слабых сторонах эти модели в основном пригодны для изучения ранних этапов злокачественного процесса, механизмов канцерогенеза и биологии опухоли [15].

К эктопическим вариантам ксенотрансплантации также можно отнести введение клеточной суспензии человеческой плоскоклеточной карциномы пищевода мышам Balb/c Nude внутривенно и в левый желудочек сердца (как вариант внутриартериального введения). В отличие от подкожного и даже ортотопического вариантов трансплантации опухолевого материала, в данном исследовании эти модели дали активное метастазирование в органы-мишени, характерные для этой формы рака [16].

Методы создания ортотопических моделей рака пищевода

Ортотопические ксенотрансплантаты представляют собой альтернативу эктопическим моделям, используемым для исследований рака пищевода. Их получают путем имплантации клеточной суспензии или фрагмента опухоли в пищевод животных-реципиентов.

В результате анализа литературных данных, посвященных методам создания ортотопических моделей основных форм злокачественных опухолей пищевода, были выявлены некоторые трудности и особенности, связанные с достижением поставленных задач.

Процедуры их создания технически сложны, поскольку для этого требуются хирургическое вмешательство и анестезия животных. Отмечают особую трудность выполнения манипуляций по ортотопической ксенотрансплантации опухолей пищевода, которая связана с особенностями расположения и малыми размерами этого органа [17]. Тем не менее достигнуты определенные успехи в создании ортотопических моделей рака пищевода, в том числе путем моделирования пищевода Барретта [7, 18].

В работе Melsens Н. et al. описано пять вариантов хирургического эзофагеального доступа: средняя лапаротомия, средняя лапаротомия с трансжелудочным подходом, подреберная лапаротомия, трансоральный и шейный доступ [17]. Несмотря на относительно большое количество доступов к пищеводу и способов установки ортотопического ксенографта, наиболее часто применяются две основные методики, отличающиеся местом имплантации опухолевого материала: 1) в верхней части пищевода, тансорально [19]; 2) в нижней его части – вблизи гастроэзофагеального перехода, через желудок [16]. Оценка выживаемости мышей с ортотопическими опухолями в верхней и нижней частях пищевода показала, что последние жили дольше [10]. Также Ip J.C.Y. et al. на мышах Balb/cAnN-nu была разработана модель, полученная путем инъекции суспензии клеточной культуры в стенку среднего отдела пищевода, вблизи диафрагмы. Авторы заявляют о ее преимуществе по сравнению с ранее разработанными ортотопическими моделями плоскоклеточного рака пищевода [20].

Инокуляции суспензией опухолевых клеток со средой, по мнению ряда авторов [8, 17], дают лучшие результаты, чем SOI (surgery orthotopic implantation) – хирургическая имплантация фрагментов опухолевого материала в стенку пищевода [16]. Показано также, что улучшает приживаемость трансплантатов применение различного рода подложек и гидрогелей, например Matrigel [17, 21]. Последний представляет собой сложную смесь белков, протеогликанов и факторов роста межклеточного матрикса, которая обеспечивает клетки питанием и стимулирует их рост.

Существенными недостатками ортотопической модели рака пищевода являются медленный рост ксенотрансплантата [8, 17, 21], а также необходимость применения специализированных методов визуализации in vivo для мониторинга роста опухоли [22, 23].

Хотя создание ортотопических моделей требует больше времени, материальных и трудозатрат, они позволяют осуществлять исследование роста опухоли в адекватном гистологическом и молекулярном микроокружении, приближенном к клинической ситуации, и учитывать опухоле-стромальные взаимодействия [15]. Ксенотрансплантаты на основе полученного от пациентов опухолевого материала наиболее полно отражают иммуногистохимические и биохимические аспекты опухолевой болезни организма-донора по сравнению с подкожными ксенографтами, полученными в результате перевивки культуры клеток рака пищевода [21]. Несмотря на существующие трудности, связанные с созданием ортотопических ксенотрансплантатов, имеющиеся преимущества в виде способности к инвазии и метастазированию делают их ценной моделью для исследований поздних стадий опухолевого роста [24].

Основные характеристики и особенности методик по созданию подкожных и ортотопических ксеногенных моделей опухолей пищевода человека с использованием иммунодефицитных животных представлены в таблице.

Основные характеристики методов создания ксеногенных моделей опухоли пищевода человека с использованием иммунодефицитных животных

Примечания: п/к – подкожная имплантация; о/т – ортотопическая имплантация

Использование ортотопических моделей рака пищевода в доклинических исследованиях (ДКИ)

В результате анализа доступных литературных источников были получены сведения о различных направлениях доклинических испытаний новых противоопухолевых препаратов и воздействий на моделях животных с пациентоподобными опухолями пищевода.

Так, например, Nishikawa T. et al. продемонстрировали антипролиферативный эффект нового ингбитора mTOR – темсиролимуса на nude-мышах. Успешность испытания выражалась в почти шестикратном торможении роста подкожных ксенографтов по сравнению с контролем и в достоверном увеличении продолжительности жизни животных-опухоленосителей с ортотопически перевитым плоскоклеточным раком пищевода [25].

Также было изучено фармакологическое действие β-нитростирола (производного CYT-Rx20) на клетки рака пищевода в ДКИ, проведенном на мышах Chiu W-C. et al. В данном исследовании удалось выявить цитотоксическое действие препарата, выражавшееся в стимуляции апоптоза злокачественных клеток. Доказано ингибирование миграции и инвазии раковых клеток линии KYSE70 in vitro, и, кроме того, было продемонстрировано значительное торможение опухолевого роста и снижение частоты метастазирование в легкие мышей-опухоленосителей на ортотопической модели рака пищевода [26].

В опытах, проведенных на иммунодефицитных крысах с ортотопически перевитой плоскоклеточной карциномой, предварительно пассированной в подкожном сайте мышей nude, показана возможность повышения эффективности химиотерапии за счет применения внутрипищеводной радиочастотной гипертермии [9].

Применение нового аналога куркумина SSC-5 привело к ингибированию роста и инвазии плоскоклеточного рака пищевода, ортотопически перевитого nude-мышам [10].

Тестирование аденовирусной вакцины Ad.E7 было проведено на мышах с ортотопической опухолью рака пищевода. Выявлено, что вакцинация способствовала снижению локального опухолевого роста и увеличению общей выживаемости животных-опухоленосителей [27].

Определение онкогенных потенций медицинских иммунобиологических препаратов также является одним из обязательных разделов доклинических исследований, в которых используют ксенографты опухолей пищевода [8].

Помимо вышеперечисленных направлений, модели ксенотрансплантатов опухолей пищевода применяются в разработках по созданию и усовершенствованию новых методов биомедицинской визуализации, призванных контролировать злокачественный рост и терапевтический эффект от применяемых противоопухолевых воздействий. Так, на мышиных моделях получены биолюминесцентные изображения ортотопических опухолей пищевода, а также регионарных и отдаленных метастазов [20, 21, 22]. Параллельное использование методов флюоресценции и МРТ повышает точность дифференцировки жизнеспособных опухолевых клеток от рубцовой ткани и остатков препарата Matrigel после ксенотрансплантации аденокарциномы пищевода [28]. Эксперименты на животных показали, что использование контрастного агента в оптической когерентной томографии может повысить эффективность обнаружения опухолей даже на ранних стадиях злокачественного процесса [29]. В исследованиях плоскоклеточного рака пищевода были предприняты активные шаги к повышению разрешающей способности оптической когерентной томографии, чтобы получить возможность послойной визуализации стенки пищевода мыши [30]. Такие усилия дали положительный результат благодаря эффективному усилению контрастности изображения в экспериментальных исследованиях, связанных с применением наночастиц в качестве контрастного агента [31].

Заключение. В целом модели опухолевых ксенотрансплантатов являются универсальной экспериментальной платформой для исследований канцерогенеза, опухолевого роста и прогрессии, а также могут успешно применяться для доклинического тестирования препаратов и разработки методов биомедицинской визуализации.