Хроническое употребление алкоголя приводит к различным нарушениям в работе центральной нервной системы, включая функциональные, структурные, клеточные и молекулярные повреждения [1]. Действие этанола сопровождается уменьшением объема серо-белого вещества, микроструктурным разрушениям различных участков белого вещества, вызывает снижение объема гиппокампа и увеличение размеров желудочков мозга оказывает влияние на определенные нейромедиаторные системы [2]. Структурные нарушения, вызванные злоупотреблением алкоголя, приводят к изменениям функции мозга: гиперактивности, умственной отсталости, депрессии и когнитивной дисфункции [3,4]. Большое количество исследований посвящено раскрытию механизмов нейротоксического действия этанола. Особое внимание в патогенезе алкоголь-индуцированного повреждения нейронов уделяется роли окислительного стресса и запрограммированной клеточной гибели [5]. 

В связи с этим поиск лекарственных средств, обладающих доказанным регулирующим, антиоксидантным и протекторным действием и направленных на защиту нейрона при алкогольной зависимости - актуальное направление современной психофармакологии. Перспективным в этом отношении представляется нейропротектор кортекин (препарат полипептидной природы, получаемый путём экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота; производитель «Герофарм», Россия). В его составе до 90% олиго- и коротких пептидов и около 10% различных аминокислот, а также набор разнообразных микроэлементов (марганец, медь, цинк, селен, и др.), принимающих участие в активности более 1000 внутриклеточных ферментов и белков, регулирующих процессы клеточной динамики. Кортексин воздействует на разные этапы патологической цепи молекулярных событий, приводящих к нейрональной гибели [6]: регулирует процесс перекисного окисления липидов и метаболизм нейромедиаторов и в коре головного мозга, увеличивает эффективность энергетического метаболизма нейронов, препятствует образованию избыточного количества свободных радикалов, устраняет дисбаланс тормозных и возбуждающих аминокислот, обладает умеренным GABA-ергическим действием. Препарат успешно применяется в терапии различных психических и неврологических расстройств. Имеются исследования, доказывающие, что включение кортексина в стандартные схемы терапии алкогольной зависимости приводит к улучшению концентрации внимания, кратковременной памяти, способности к обучению, снижению уровня невротизации и тревоги, улучшению самочувствия пациентов, улучшению настроения, повышению самооценки, снижению уровня окислительного стресса [7].

В качестве экспериментальной модели нами использована клеточная линия нейробластомы мыши С-1300. Клетки нейробластомы обладают рядом важнейших свойств, типичных для нервных клеток: у них имеются ионные каналы и рецепторы, они электрически и химически возбудимы, обладают ферментативным аппаратом, для синтеза медиаторов, образуют отростки. Относительная простота в использовании и высокая скорость роста культуры клеток нейробластомы позволяет широко применять ее в научных исследованиях для изучения дифференцирующих и нейропротекторных свойств различных биологически активных соединений [8,9].

Целью настоящей работы явилось изучение влияния кортексина на показатели апоптоза клеток нейробластомы C-1300 в условиях индуцированного окислительного стресса и под влиянием этанола.

Материалы и методы исследования

Реактивы: В работе использовали среду Игла в модификации Дульбекко (DМЕМ), DМЕМ в модификации Искова (IМЕМ), пенициллин (Sigma-Aldrich, США), стрептомицин (Sigma-Aldrich, США), инактивированную эмбриональную телячью сыворотку (БиолоТ, Санкт-Петербург), препарат полипептидной природы «Кортексин» (ООО «Герофарм», Россия), гидроперекись трет-бутила (ГПТБ) (Fluka, Германия), наборы для иммуноферментного анализа Caspase-3 ELISA и Bcl-2 ELISA (Bender MedSystems GmbH, Австрия).

Культивирование нейробластомы: клетки нейробластомы мыши С-1300 культивировали в среде DMEM/IMEM (3:1), содержащей 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при 36^o C, 90% влажности в атмосфере с 5% CO₂  в СО₂ –инкубаторе (Sanyo, Япония). Смену среды проводили каждые 2-3 дня.

Для выявления эффекта кортексина клетки нейробластомы рассаживали в культуральные флаконы (75 см², 4х10⁵ клеток на флакон) и спустя сутки инкубировали с препаратом в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 16 часов, затем на 4 часа вносили индуктор окислительного стресса - гидроперекись третичного бутила (ГПТБ) в конечной концентрации 140 мкМ или этанол в конечной концентрации 0,5 %.

Для оценки действия ГПТБ и этанола на клетки нейробластомы проводили инкубацию культур с указанными веществами по той же схеме, внося на 16 часов культуральную среду в тех же объемах, что и раствор кортексина, а потом на 4 часа – ГПТБ или этанол в вышеуказанных концентрациях.

В качестве контроля использовали культуру, в которую оба раза вносили эквивалентные объемы культуральной среды. Указанные концентрации исследуемых веществ были подобраны, исходя из результатов ранее проведенных предварительных экспериментов и литературных данных [10].

По окончании инкубации клетки отмывали в физиологическом растворе, осаждали центрифугированием, суспендировали в 1 миллилитре лизирующего буфера и замораживали на – 80^оС.

Изучение протекторных свойств: концентрацию проапоптотического белка каспаза-3 и антиапоптотическго белка Bcl-2 определяли в клеточном лизате методом иммуноферментного анализа с использованием наборов Caspase-3 ELISA и Bcl-2 ELISA фирмы «Bender MedSystems GmbH» (Австрия). Постановку реакции проводили в соответствии с прилагаемой инструкцией фирмы-производителя. Результаты анализа оценивали на автоматическом микропланшетном спектрофотометре «EpochBioTekInstruments» (США) при длине волны 450 нм.

Статистическую обработку результатов производили с помощью программ Statistica, версия 8.0 для Windows. Проверку на нормальность распределения значений переменных проводили по критерию Колмогорова-Смирнова. Данные (в нг Bcl-2 или мкг каспазы 3 на мл лизата клеток) представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей (Me (Q_L-Q_U)). Для сравнения количественных переменных использовались критерии Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В качестве индукторов клеточной гибли нами использовались этанол и гидроперекись третичного бутила (ГПТБ) с целью моделирования ситуации окислительного стресса. Данный подход позволяет эффективно имитировать выраженный окислительный стресс и оценить протекторное и антиоксидантное действие, направленное на нейтрализацию активных радикалов, что приобретает важное значение при алкогольной зависимости, сопровождающейся развитием в организме окислительных процессов, повышением эндогенной генерации активных форм кислорода и, как следствие, к срыву защитных механизмов и активации окислительного стресса. Окислительный стресс, при аддиктивной патологии, отражается на функционировании разнообразных органов и систем, имеет огромное значение в развитии клинического течения заболевания и в формирование соматических осложнений, а также играет существенную роль в активации процессов апоптоза [7].

Измерение концентраций внутриклеточных регуляторных белков с целью изучения протекторного влияния лекарственного биорегулятора кортексина представляется целесообразным, поскольку именно относительный уровень протеаз определяет дальнейшую судьбу клетки. Белки семейства Всl, в частности Всl-2 (Apoptosis regulator Bcl-2) – важнейшие регуляторы клеточной гибели, в результате избыточного присутствия данных белков в клетке формируются факторы, ингибирующие апоптоз. Другим ключевым моментом в промежуточных и терминальных стадиях программированной клеточной гибели является активность ферментов семейства каспаз. Каспаза-3 играет важнейшую роль в исполнении внутриклеточной апоптотической программы клеток головного мозга.

По результатам проведенного эксперимента, концентрация внутриклеточного регуляторного белка Bcl-2 в интактных клетках нейробластомы составила 20,20 (17,77-23,50) нг/мл. Добавление в культуральную среду как гидроперекиси третичного бутила, так и этанола приводило к статистически значимому снижению уровня исследуемого антиапоптотического белка по сравнению с контрольными культурами нейробластомы (табл. 1).

Таблица 1

Концентрация антиапоптотического белка Bcl-2 (нг/мл) в клетках нейробластомы при воздействии кортексина, Me (Q_L-Q_U)

Примечание. * – р<0,05 по сравнению с интактными клетками (контроль); # – p<0,05 по сравнению с инкубацией в тех же условиях без протектора.

Полученные данные о нарушениях процессов запрограммированной клеточной гибели, в частности об изменениях уровня внутриклеточных регуляторных белков в условиях окислительного стресса и под воздействием этанола согласуются с литературными данными [11]. Tejedo J. C. с соавторами [12] показали токсическое воздействие оксида азота на клетки RINm5F, в результате которого происходит индукция апоптотических событий, таких как выделение цитохрома С из митохондрий, регуляция внутриклеточного белка Bcl-2, активация каспазы 3, фрагментация ДНК. Kapasi A.A. с соавторами показали, что инкубация   с этанолом в течение 16 часов в концентрации 50 мМ и выше приводит к увеличению апоптоза клеток Jurkat, так добавление этанола в концентрации 100 мМ вызывало двукратное увеличение экспрессии Bax и снижение экспрессии белка Bcl-2 в Jarkat-клетках, а также приводило к перемещению цитохрома С в цитозоль.  Хроническое употребление алкоголя оказывает влияние на активацию проапоптотического белка caspase-3 и снижение экспрессии Bcl-2 в Т-лимфоцитах пациентов.  [13].

Кортексин оказывал нейропротекторное действие в условиях ГПТБ- и этанол-индуцированного нарушения уровня антиапоптотического белка: наблюдали статистически значимое увеличение концентрации исследуемого белка в клеточных культурах нейробластомы, по сравнению с инкубацией в тех же условиях без добавления протектора (табл.1).

Концентрация каспазы-3 в интактных культурах нейробластомы составила 2,61 (2,43—3,47) мкг/мл. Инкубация клеток с добавлением 0,5% этанола не вызывала значимых изменений изучаемого параметра. В то время как культивирование с добавление ГПТБ приводило к индукции апоптоза клеток нейробластомы, что выражалось в статистически достоверном увеличение уровня проапоптотического белка по сравнению с контрольными культурами (табл. 2). Полученный результаты свидетельствуют о более токсическом воздействии активных форм кислорода, нежели самого этанола на регуляторные белки апоптоза.

Таблица 2

Концентрация проапоптотического белка каспазы-3(мкг/мл) в клетках нейробластомы при воздействии кортексина, Me (QL-QU)

Примечание. *- р<0,05 по сравнению с интактными клетками (контроль).

Показаны защитные свойства исследуемого лекарственного препарата на уровень проапоптотического белка в условиях экспериментального окислительного стресса: инкубация в присутствии ГПТБ и кортексина приводит к нормализации концентрации каспазы-3. Изменений в содержании исследуемого белка при культивировании с кортексином в условиях этанол-индуцированного воздействия отмечено не было (табл. 2).

Полученные экспериментальные данные доказывают нейропротекторные свойства кортексина, что согласуется с уже известными литературными данными. Ранее было продемонстрировано влияние препарата на выживаемость культивируемых нейронов в условиях перекисной интоксикации [14]. Показано, что препарат оказывает влияние на показатели апоптоза после воздействия токсических концентраций глутамата в молодых и старых нейронах и способен восстанавливать содержание АТФ [6]. Позитивный эффект кортексина при инкубации нейронов в отсутствие ростовых факторов подтверждает нейротрофический механизм действия препарата. На модели острой гипоксии у крыс было установлено тормозящее апоптоз влияние кортексина и нивелирование программируемой гибели нейронов, провоцируемой ишемией [15]. Показано участие кортексина в экспрессии нейротрофических факторов, энергетическом обеспечении нервной клетки, функционировании рецепторов глутамата и регулировании содержания кальция в клетке, а также наличие разнообразных эффектов, затрагивающих каскадную регуляцию клеточной динамики и гибели, что определяет нейротрофическое и нейропротекторное действие препарата [6].

Заключение

В результате проведенного исследования было показано, что в условиях экспериментального окислительного стресса в клеточных культурах нейробластомы наблюдается достоверное увеличение концентрации проапоптотического белка каспазы-3 и статистически значимое уменьшение содержания антиапоптотического белка Bcl-2. Инкубация клеток с этанолом приводила к достоверному снижению уровня Bcl-2 по сравнению с интактными клетками, изменений в концентрации каспазы-3 не было обнаружено.

Кортексин, в условиях эксперимента, оказывает выраженный нейропротекторный эффект сдерживая токсическое действие гидроперекиси и этанола, что проявляется в снижении концентрации каспазы-3 и достоверном увеличении уровня Bcl-2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в клетках нейробластомы С-1300 возможным механизмом реализации защитного эффекта исследованного лекарственного препарата является восстановление нарушенного баланса про- и антиапоптотических белков, и позволяют патогенетически обосновать применение нейропептидов в комплексных программах терапии аддиктивных расстройств.

Авторы выражают признательность старшему научному сотруднику лаборатории молекулярной генетики и биохимии НИИ психического здоровья Л.П. Смирновой за методическую помощь в проведении эксперимента.

Исследование частично выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект №17-75-20045) «Действие органических солей лития на клетки и плазму крови больных с расстройствами аффективного спектра и синдромом зависимости».