Старение – закономерный биологический процесс, сопровождающийся сложными метаболическими, функциональными и структурными изменениями, характеризующийся неуклонным прогрессированием и затрагивающий все уровни биологической организации. Процесс старения нарастает во времени и сопровождается формированием сцепленных с ним болезней и увеличением вероятности смерти. Эти изменения у лиц одного и того же возраста имеют существенные, индивидуальные различия, связанные с особенностями генетического аппарата и его фенотипической реализацией, своеобразием биохимического гомеостаза и нейроэндокринной регуляции, образом жизни, физической активностью, вредными привычками, стрессами, условиями окружающей среды и др.

Население большинства стран Земли быстро стареет: в 1950 г. в возрасте старше 60 лет было лишь 8% мирового населения, в 2000 г. – 10%, а к 2050 г., согласно прогнозу ООН, будет 21% [1], и к настоящему времени становится важным не только продолжительность жизни, но и её качество. Особое влияние на качество жизни оказывает состояние кожи. В отличие от внутренних органов, инволюционные изменения которых происходят достаточно скрытно, возрастные изменения кожи человека обнаруживается относительно рано.  С возрастом кожа дрябнет, она истончается, становится сухой, тусклой, снижаются её тургор и эластичность, появляются морщины, пигментация и другие изменения.

В дерме наблюдается снижение васкуляризации уровня прогениторных мезенхимальных стволовых клеток, что приводит к уменьшению численности биосинтетически активных фибробластов [2]. Как результат понижается продукция таких структурных компонентов внеклеточного матрикса, как гиалуроновая кислота, протеогликаны и фибриллярные белки, необходимых для поддержания тургора, упругости, эластичности, микрорельефа кожи и ее устойчивости к возрастным изменениям. В возрастных изменениях кожи особое внимание привлекает гиалуронан, количество которого в стареющей коже уменьшается [3]. Гиалуронан, благодаря особенностям структуры, связывает воду в межклеточном пространстве, формируя высокогидрофильную среду, определяя тургор, влажность и тонус кожи, обеспечивая диффузию нутриенов и кислорода из дермы в эпидермис [4; 5].

Уникальные физико-химические свойства гиалуроновой кислоты, её биологические функции, биосовместимость и способность взаимодействовать с другими компонентами экстрацеллюлярного матрикса, фибробластами привлекли внимание к возможности использования для коррекции возрастных изменений кожи. Гиалуроновая кислота в дерме не только определяет ряд биомеханических характеристик кожи, но участвует в процессах регуляции деления, дифференцировки, миграции, апоптоза клеток, синтеза и секреции медиаторов воспаления, защиты от окислительного повреждения [4-6]. Не случайно инъекционные и косметические средства на основе гиалуроновой кислоты нашли широкое применение в эстетической медицине. Однако значительный практический опыт их применения основан на констатации визуализируемых изменений кожи, и биохимические механизмы действия препаратов на основе гиалуронана требуют дальнейших исследований.

Цель исследования

Определить динамику изменений интерлейкина – 1 бета, фактора некроза опухолей – альфа, инсулиноподобного ростового фактора 1 и трансформирующего ростового фактора – бета 1 в сыворотке крови при внутридермальном введении экспериментальным животным зрелого возраста нативного высокомолекулярного гиалуронана.

Материал и методы исследования

Исследования проведены на 72 самках белых крыс зрелого возраста (11-12 месяцев) массой 280-320 г с соблюдением международных требований этических норм и рекомендаций по гуманному отношению к животным, используемым в экспериментальных и других научных целях. Крысам опытной группы под лёгким эфирным наркозом вводили препарат Juvederm Hydrate^TM (Франция), содержащий 13,5 мг геля гиалуроновой кислоты молекулярной массы 1 млн дальтон и 9 мг маннитола в 1 мл фосфатного буфера рН 7,4, из расчета 0,06 мг на 100 г массы тела. Контрольной группе крыс вводили стерильный физиологический раствор хлористого натрия. Инъекции проводили внутридермально техникой мезотерапии на боковые поверхности туловища (площадь 3х3 см) после удаления шерстяного покрова трижды на 1, 3 и 6-е сутки эксперимента. Животных на 2, 4, 7, 21 и 37-е сутки после первой инъекции выводили из опыта декапитацией под лёгким эфирным наркозом. В сыворотке крови определяли содержание интерлейкина – 1 –бета (IL-1β), фактора некроза опухолей – альфа (TNF-α) с использованием наборов реагентов «ИФА-ИЛ-1 β» и «ИФА-ФНО-альфа» ТОО «Протеиновый контур», а также инсулиноподобного ростового фактора 1 (IGF -1) – реагенты IGF ELISA (Mediagnost), трансформирующего ростового фактора бета 1 (TGF-β1) – реагенты TGF-β1 ELISA (Affimetrixe Biosiense), методом твердофазного иммуноферментного анализа на анализаторе Stat Fox 2100 согласно протоколу производителя.

Статистическую обработку результатов осуществили с использованием пакета программы Statistica 6 for Windows c расчетом медианы, верхнего и нижнего квартилей. Межгрупповые различия показателей оценивали по U-критерию Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Содержание определяемых в сыворотке крови животных изучаемых цитокинов представлено в таблице. Уровень провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α в первую неделю опыта на следующие дни после введения препарата гиалуроновой кислоты (2, 4 и 7-е сутки) повышался, а в более отдаленные сроки, через 2-4 недели после завершения курсовой инъекции, не отличался от контрольных значений. 

Содержание цитокинов в сыворотке крови самок крыс зрелого возраста при внутридермальном введении препарата гиалуронана

Примечание: * - Р<0,05; ** - Р<0,01 по сравнению с контролем.

IL-1β и TNF-α являются плейотропными медиаторами воспаления. IL-1β многофункциональный цитокин с широким спектром действия, играет роль в развитии и регуляции неспецифической защиты и специфического иммунитета, включается одним из первых в ответную защитную реакцию при действии стрессорных факторов. Основными продуцентами IL-1β являются макрофаги и моноциты, хотя может вырабатываться иммунокомпонентными, эпителиальными и эндотелиальными клетками, фибробластами и др. Клетками-мишенями являются иммунокомпетентные, эндотелиальные и эпителиальные клетки, кератиноциты, гепатоциты, фибробласты и др. Он инициирует и регулирует воспалительные и иммунные процессы, активирует нейтрофилы, лимфоциты, стимулирует синтез провоспалительных цитокинов (IL-2,-3,-6,TNF-α), молекул адгезии, простагландитов, белков острой фазы, индуцирует образование  активных форм кислорода, повышает проницаемость сосудистой стенки [7-12].  

Многие функции TNF-α идентичны функциям IL-1. Особенно интенсивно и достаточно быстро вырабатывается активированными мононуклеарными фагоцитами. Его могут продуцировать также фибробласты, дендритные клетки, тучные клетки, Т-лимфоциты, гемопоэтические и эндотелиальные клетки [13]. Он индуцирует синтез простациклина (простагландина I₂), экспрессию молекул адгезии (ELAM-1, ICAM-1) и мембранно-ассоциированного IL-1, повышает секрецию IL-2, IL-6, IL-8, гранулоцито-макрофагального  колонийстимулирующего фактора (GM-CSF), моноцитарного хемотоксического белка и др. [7; 14]. TNF участвует и регулирует множество биологических процессов, включая воспалительную реакцию, пролиферацию, дифференцировку и гибель различных клеток, врождённый и приобретенный иммунитет. Рецепторы к TNF – TNFR 1/p55 иTNFR2/p75 экспрессируются большинством клеток. Связывание цитокина с рецепторами включает сигнальные каскады, ведущие к активации митогенактивируемых протеинокиназ и транскрипционных факторов, включая ядерный фактор каппа би (NFkB) активирующий протеин, которые регулируют экспрессию генов – медиаторов воспаления [15; 16], вызывает также экспрессию протоонкогенов с-myc, с-fos и c-jun [7]. TNF-α индуцирует поляризацию М1-фенотипа макрофагов, вырабатывающих воспалительные цитокины, простациклин, антимикробные молекулы и активные формы кислорода [17; 18]. IL-1β и TNF-α действуют синергично на фибробласты, стимулируя их пролиферацию, активируя метаболические процессы в соединительной ткани, что важно для восстановления целостности ткани после повреждений [14].

Повышение уровня IL-1β и TNF-α в первые дни после введения гиалуроновой кислоты, вероятно, связано с развитием воспалительной реакции ткани кожи на процедуру внутридермальной инъекции. При субдермальном введении экспериментальным животным нативной и модифицированных форм гиалуроновой кислоты наблюдался воспалительный ответ на повреждение, который сопровождался умеренной нейтрофильной инфильтрацией, сменяющейся в динамике на лимфоцитарно-макрофагальную [19].

Увеличение содержания TGF-β1, установленного в первые дни наших экспериментов, по всей вероятности, тоже связано с реакцией воспалительного ответа кожи на внутридермальное введение препарата гиалуроновой кислоты. TGF-β1 является членом суперсемейства трансформирующего ростового фактора, насчитывающего около 100 представителей, действует на клетки через рецепторы – серин/треонинпротеинкиназы, использует SMAD – синтез внутриклеточного распространения сигналов [20]. Он также продуцируется активированными макрофагами, Т-лимфоцитами, фибробластами, фиброцитами [21]. Однако при этом TGF-β1 оказывает противовоспалительный эффект, подавляя синтез провоспалительных цитокинов и ответ лимфоцитов на действие IL-2,-4,-7, формирование цитоксических NK-и T-клеток, снижает цитотоксическую и цитокинпродуцирующую активность моноцитов/макрофагов. TGF-β1 индуцирует макрофаги М2-фенотипа, экспрессирующие ростовые факторы и ингибиторы воспаления, необходимые для разрешения воспаления, восстановления и заживления [22]. Несмотря на плейотропный характер эффектов, основное действие TGF-β1 направлено на стимулирование пролиферации и роста клеток.

К группе сигнальных молекул, основное действие которых направлено на стимулирование пролиферации и роста клеток, хотя также обладает плейотропным характером эффекта, относится IGF-1 [23]. По структуре IGF-1 близок к инсулину (43% гомологии), продуцируется гепатоцитами, клетками соединительной и других тканей (в основном под контролем гормона роста), обладает прямым эффектом in vivo и in vitro, относится к аутокринно–парокринным факторам. Своё действие оказывает через рецептор IGFR-1 и частично через рецептор инсулина IR. Его взаимодействие с рецептором, обладающим тирозинкиназной активностью, включает в дальнейшем активацию (фосфоримирование) допинг–белков нескольких путей интерцеллюлярного распространения сигналов, приводящих к стимуляции клеточной дифференцировки и пролиферации [24]. Уровень IGF-1 в сыворотке крови в первые дни эксперимента (2, 4, 7-е сутки) не подвергался статически значимым колебаниям, и повышение его содержания обнаруживалось в более отдалённые сроки – на 21-е и 37-е сутки опыта, и его увеличение может быть косвенным отражением стимуляции процессов пролиферации и роста клеток кожи в зоне введения гиалуронана.

Об этом свидетельствует и сохранение повышенного содержания в сыворотке крови TGF-β1 на 21-е и 37-е сутки эксперимента. Под влиянием TGF-β1 происходит активная дифференциация циркулирующих фиброцитов в репаративные фибробласты [25], трансдифференциация клеток эктодермального происхождения также в репаративные фибробласты [26], интенсивно продуцирующие коллаген и другие компоненты внеклеточного матрикса. При введении геля гиалуроновой кислоты в кожу экспериментальных животных на фоне интенсивной резорбции гиалуроновой кислоты активизировалась  пролиферация фибробластов и процессы неоангиогенеза [19], увеличение содержания в коже нейтральносолерастворимой фракции и суммарного коллагена [27].

Заключение

Внутридермальное введение высокомолекулярной нативной гиалуроновой кислоты методом мезотерапии приводит у животных зрелого возраста в первые дни после процедуры инъекций к усилению секреции IL-1β, TNF-α и TGF-β1, что может отражать воспалительную ответную реакцию ткани кожи. В отдаленные сроки, через 2-4 недели после мезотерапии, уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке крови снижается, увеличивается продукция IGF-1, а TGF-β1 сохраняется повышенным, характеризуя усиление процессов пролиферации и активации биосинтетических процессов в области инъекции препарата гиалуронана.