В последнее время большое внимание уделяется изучению влияния ионов тяжелых металлов на устойчивость мембраны эритроцитов, так как основной мишенью их токсического воздействия на клетки является именно биологическая мембрана [1]. Ранее было установлено, что ионы тяжелых металлов оказывают влияние на мембранную устойчивость эритроцитов, которая выражается в изменении оптической плотности суспензии эритроцитов в зависимости от концентрации и длительности воздействия тяжелых металлов. Токсическое действие различных соединений тяжелых металлов обусловлено образованием прочных связей тяжелых металлов с белками мембраны, нарушая ее проницаемость для ионов и стабильность белково-липидных комплексов. Подобное действие «белковых ядов», активно фиксирующихся на красных кровяных клетках, приводит к нарушению целостности мембраны эритроцитов [2].

В Республике Башкортостан расположено одно из крупнейших предприятий горнодобывающей промышленности – ОАО «Учалинский горно-обогатительный комбинат» (УГОК), где добываются 70 % цинка и 30 % меди в России [3]. У рабочих, постоянно контактирующих при добыче руды с полиметаллической пылью, изменяется функциональное состояние организма, снижаются его адаптационные возможности, что приводит к повышению риска возникновения профессиональных и общих заболеваний [4]. Например, развиваются системные изменения костной ткани с высокой частотой остеопении и остеопороза. Одним из патогенетических механизмов развития нарушений метаболизма костной ткани может быть избыточное поступление и накопление таких элементов, как медь, цинк, хром, свинец, кадмий и мышьяк [5]. Известно, что многие токсические вещества, такие как полихлорированные бифенилы, диоксинсодержащие вещества индуцируют процессы свободнорадикального окисления, которые протекают в липидном слое мембран клеток, что приводит к уменьшению ненасыщенности ее жирнокислотных компонентов, к уменьшению микровязкости и, следовательно, пластичности мембраны [6,7].

В связи с предполагаемым мембранотоксическим действием медно-цинковой колчеданной руды нами были изучены осмотическая резистентность эритроцитов, которая отражает функциональное состояние эритроцитов при адаптации к различным стрессовым факторам [8]. По осмотической эритрограмме можно судить об интенсивности и характере кроветворения, в частности, эритропоэзе. Исследования были проведены в гематологической лаборатории кафедры нормальной физиологии ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет», город Уфа.

Цель. Изучить динамику показателей красной крови и осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) периферической крови при длительном воздействии медно-цинковой колчеданной руды на организм экспериментальных животных в условиях in vivo и в эксперименте in vitro.

Материал и методы. Эксперименты проведены на 90 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 200–300 граммов. Животным опытной группы (n=60) в течение четырех месяцев индивидуально ежедневно перед стандартным кормлением один раз в сутки перорально вводили рудный порошок, из расчета 60 мг руды на 100 г веса животного. Все болезненные манипуляции с крысами, в том числе забор крови, осуществляли под эфирным наркозом в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики», утвержденным и введенным в действие Приказом Ростехрегулирования от 02.12.2009 (№ 544-ст ГОСТ Р. 53434-2009). Забор крови осуществляли из хвостовой вены на 10-е, 30-е, 60-е, 90-е и 120-е сутки эксперимента. Действие руды изучали на модели осмотического гемолиза эритроцитов с применением растворов убывающих концентраций хлорида натрия [9]. В опыте in vitro в пробирки с раствором хлорида натрия добавляли 50 мг порошка медно-цинковой колчеданной руды и 20 мкл крови интактных крыс. Степень гемолиза эритроцитов оценивали на спектрофотометре ПЭ-5400ВИ при длине волны 540 нм. Воздействие медно-цинковой колчеданной руды на разные популяции эритроцитов рассчитывали следующим образом: высокоустойчивые молодые клетки с процентом гемолиза 90 % (р90); среднеустойчивые зрелые эритроциты, процент гемолиза составил 50 % (р50) и низкоустойчивые старые клетки, характеризующееся 10 % гемолиза (р10). По результатам осмотического гемолиза строили эритрограммы.

На ветеринарном гематологическом анализаторе Эксиго (Vet Exigo 19, Sweden) в периферической крови определяли следующие показатели: абсолютное количество эритроцитов (RBC (1012/L)), уровень гемоглобина (HGB (g/L)), гематокрит (HCT (%)), средний объем эритроцитов (MCV (fL)), среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (MCH (pg)) и среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах (MCHC (g/L)), ширину распределения эритроцитов в абсолютных единицах (RDWa (fL)) и в процентах (RDW (%)). Статистическую обработку полученных данных проводили в программе StatSoft Statistica 10. Для каждого показателя рассчитывали среднее значение и стандартную ошибку среднего значения. В качестве критерия оценки достоверности различий между опытными и интактными животными использовали непараметрический критерий достоверности Манна – Уитни. Различия считались достоверными при р < 0,05.

Результаты и обсуждения. На рисунке 1 представлены эритрограммы крови крыс контрольной и опытной групп в эксперименте in vivo на 10-е, 30-е, 60-е, 90-е, 120-е сутки.

Рис. 1. Эритрограммы осмотической резистентности эритроцитов под влиянием медно-цинковой колчеданной руды in vivo

Осмотическая резистентность популяции низкоустойчивых эритроцитов (р10) в опытных группах на разных сроках введения руды в целом существенно не отличалась от контрольных величин, однако на 120-е сутки эксперимента гемолиз эритроцитов наступал при более высоких концентрациях хлорида натрия, свидетельствуя о наиболее низкой резистентности старых клеток крови. Судя по сдвигу эритрограмм влево, то есть в область повышенной концентрации NaCl, в опытных группах уже на 10-е сутки эксперимента снижалась осмотическая резистентность популяции среднеустойчивых эритроцитов (р50). Так, в контроле р50 соответствовало 0,3 % NaCl, а в опытной группе – 0,37 % NaCl. На 30-е, 60-е и 90-е сутки эксперимента сдвиг увеличивался и соответствовал 0,41 % NaCl. На 120-е сутки сдвиг усиливался и р50 приходилось на 0,44 % NaCl. Для популяции высокоустойчивых эритроцитов (р 90) наблюдалась аналогичная, но менее выраженная тенденция. В контрольной группе р90 приходилось на 0,14 % NaCl, в опытной группе на 10-е сутки – на 0,16 % NaCl, на 120-е сутки – на 0,2 % NaCl.

В условиях in vitro под влиянием медно-цинковой колчеданной руды эритрограмма сдвигалась влево (рис. 2) для р50 и р90. Популяция низкоустойчивых эритроцитов (р10) в опыте «руда in vitro» и в образце «контроль» отличалась незначительно. В наибольшей степени местное действие руды наблюдалось на популяции молодых клеток (р90). В образце «контроль» р90 приходилось на 0,14 % NaCl, а в образце «руда in vitro» соответственно на 0,2 % NaCl, что соответствовало значению ОРЭ р90 опыта in vivo на 120-е сутки воздействия руды.

Рис. 2. Эритрограммы осмотической резистентности эритроцитов под влиянием медно-цинковой колчеданной руды in vitro

Результаты анализа количественных показателей красной крови представлены в таблице. На 10-е сутки воздействия медно-цинковой колчеданной руды наблюдалось увеличение показателя MCV на фоне снижения показателя HGB и эритроцитарного индекса MCHC. На 30-е сутки введения руды в организм крысы отмечалось снижение всех показателей красной крови, кроме эритроцитарного индекса MCV, который увеличился на 2,31 % по сравнению с контрольной группой. На 60-е сутки эксперимента тенденция к увеличению объема эритроцитов сохранялась. MCV достигал максимального значения на 120-е сутки воздействия медно-цинковой колчеданной руды и отличался от величины MCV контрольной группы на 10,22 %. Параллельно происходило увеличение показателя RDWа на 14 % по сравнению с контрольным значением, свидетельствующее об анизоцитозе. Динамика эритроцитарного индекса МСНС, свидетельствующая о степени насыщенности эритроцитов гемоглобином, имела волнообразный характер, так на 10-е и 60-е сутки снижался, а на 30-е сутки повышался, далее на 120-е сутки отмечалась стабилизация с приближением к значению контрольной группы. Значение показателей RBC, HCT, HGB повторно снижалось на 120-е сутки эксперимента, что свидетельствовало о срыве регуляций, связанных с производством эритроцитов в костном мозге.

Динамика изменения гематологических показателей красной крови крыс при длительном воздействии медно-цинковой колчеданной руды

Примечания: р – достоверность отличий показателей опытной группы от контрольной, рассчитанная с помощью теста Манна – Уитни.

Увеличение объема происходило при одновременном снижении устойчивости к гемолитическому воздействию. Очевидно, под действием медно-цинковой колчеданной руды менялась проницаемость клеточных мембран, нарушался внутриклеточный баланс ионов, что приводило к набуханию эритроцитов и снижению их осмотической резистентности.

Заключение и выводы

Нарушения функций мембран под влиянием токсичных веществ во многих случаях являются причиной патологических изменений в клетке и организме в целом. Тяжелые металлы медно-цинковой колчеданной руды фиксируются на мембранах эритроцитов, блокируя тиоловые группы мембранных протеинов, нарушая стабильность их белково-липидных комплексов [10]. Вероятно, что изменения, происходящие в составе липидов мембраны, торможения в них процессов аэробного гликолиза, метаболизма и накопления гемолитически активной перекиси водорода вследствие торможения пероксидазы, приводят к развитию одного из характерных симптомов токсического действия соединений этой группы – к гемолизу [11, 12]. Известно, при энергодефиците может наблюдаться потеря эритроцитами дисковидной формы и приближение их фактического объема к критическому, что также может быть одной из причин снижения резистентности эритроцитов под воздействием длительного введения в организм тяжелых металлов. Начиная с 10-х суток введения медно-цинковой колчеданной руды в организм животного, наблюдался сдвиг эритрограмм влево и снижение осмотической резистентности эритроцитов периферической крови in vivo, свидетельствующие об отрицательном воздействии руды на эритроциты. Одновременное возрастание объема эритроцитов указывало на нарушение ионного гомеостаза, опосредованное мембранно-деструктивным воздействием руды на клетки. Учитывая, что ОРЭ является маркером степени повреждения мембран, можно констатировать, что наибольший эффект токсического воздействия медно-цинковой колчеданной руды достигался на 120-е сутки, когда гемолиз отмечался в популяции не только зрелых и молодых популяций эритроцитов, но и старых клеток. Появление эритроцитов с аномальным объемом было связано с нарушенной продукцией эритроцитов костным мозгом и другими тканями с гемопоэтическими свойствами, а увеличение численности старых эритроцитов свидетельствовало о торможении эритропоэза [13].

Таким образом, наблюдаемые изменения количественных показателей красной крови и осмотической резистентности эритроцитов могли явиться следствием как прямого, так и опосредованного воздействия тяжелых металлов и их метаболитов в составе медно-цинковой колчеданной руды на мембрану эритроцитов и клетки костного мозга, в частности, эритрона. При длительной интоксикации рудой снижается антиоксидантная активность тканей (печени, почек) в результате развивающегося дефицита природных антиоксидантов в организме, процессы перекисного окисления липидов приобретают неконтролируемый характер, что и приводит к сокращению срока жизни эритроцитов.