В структуре онкологической заболеваемости женщин рак молочной железы занимает ведущее место во многих регионах мира, в том числе и в Ростовской области [1]. В настоящее время в схемах предоперационной химиотерапии больных РМЖ наиболее часто используется включение антрациклиновых антибиотиков, одинаково блокирующих синтез ДНК и РНК и вызывающих гибель клеток. По современным представлениям существует несколько механизмов действия химиопрепаратов этого класса: 1 – интеркаляция молекулы препарата между основаниями ДНК с образованием прочного комплекса между ДНК и препаратом; 2 – связывание и ингибирование топоизомеразы II, принимающей участие в процессах организации хроматина в ходе репликации ДНК, транскрипции генов, в результате чего нарушаются синтез ДНК, ее транскрипция; 3 – помимо этого показано, что в процессе внутриклеточного метаболизма препаратов, в частности доксорубицина, при участии различных оксидоредуктаз (NAD(P)H-дегидрогеназ, ксантиноксидазы, NO-синтазы) инициируется образование свободных радикалов кислорода [10]. Образование свободных радикалов сопровождается окислительным повреждением ДНК, о чем свидетельствуют, например, данные работы Doroshow J.H. и соавт. [9], в которой показана индукция модификации оснований ДНК в мононуклеарных клетках периферической крови при введении доксорубицина. Модификация оснований ДНК приводит к образованию щелочелабильных сайтов, которые можно выявить методом ДНК-комет в щелочной версии.

Данный метод нашел применение в биомониторинговых исследованиях как критерий генотоксического действия различных внешних физических и химических факторов [5]. Кроме того, метод ДНК-комет (Comet assay) пытаются использовать в онкологии для оценки химио- и радиочувствительности опухолевых (таргетных) и неопухолевых (нетаргетных) клеток при различных методах лечения. Например, в работах Blaziak J. и соавт. [8], Сироты Н.П. и соавт. [4] показан повышенный средний уровень % ТДНК у больных РМЖ в процессе химиотерапии по схеме, включающей циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил (CMF), в сравнении со здоровыми женщинами. Результаты работ [4] и [8] существенно различаются значением базального уровня повреждения ДНК у здоровых лиц одного возрастного периода. Так, в работе [8] % ТДНК составил 0,4±0,1 %, а в работе [4] – 2,9±0,5 %. Эти различия могут быть обусловлены неидентичностью экспериментальных условий проведения щелочной процедуры Comet assay.

Целью нашей работы явилась оценка индивидуальной динамики уровня поврежденности ДНК лейкоцитов свежей цельной крови у больных РМЖ при неоадъювантной химиотерапии с использованием доксорубицина.

Материал и методы исследования

В исследовании приняли участие 17 больных раком молочной железы (T2-4N1-2M0) с гистотипом инфильтрирующая протоковая карцинома (1 женщина – люминальный А, 3 – люминальный В HER2 негативный, 9 – люминальный В HER2 позитивный, 3 – Erb-B2 сверхэкспрессирующий, 1 – трижды негативный подтипы РМЖ), в возрасте от 38 до 65 лет, получивших химиотерапевтическое лечение в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ с апреля по июль 2015 года. Неоадъювантную химиотерапию (НАХТ) проводили по схеме: 1) циклофосфамид (Бакстер Онкология ГмбХ, Германия) 500 мг/м², внутривенно, капельно, 2) доксорубицин (ОАО «Фармстандарт», Россия; ООО «ЛЭНС-Фарм», Россия) 50 мг/м², внутривенно, капельно, 3) 5-фторурацил (Эбеве Фарма ГмбХ Нфг. КГ, Австрия) 500 мг/м², внутривенно, капельно. 2-й и 3 курсы химиотерапии проводили через 21 день после инфузии на предыдущем курсе. Забор крови у больных производили утром натощак перед 1 курсом, перед началом 2 курса и перед началом 3 курса НАХТ, а также через 1–4 суток после введения химиопрепаратов на каждом курсе. По различным организационно-техническим причинам не у всех больных удалось произвести забор крови на одинаковых этапах химиотерапии. Контрольную группу составили 13 женщин без онкопатологии, в возрасте от 31 до 65 лет, обследованных в этот же период времени. Дизайн исследования был одобрен этическим комитетом ФГБУ «РНИОИ». Обязательным условием включения в исследование было добровольное информированное согласие больных и женщин из контрольной группы. Использовали свежую цельную капиллярную кровь (антикоагулянт K₂EDTA 1,0 мг). Все пробы крови не подвергались замораживанию и размораживанию.

Для оценки степени поврежденности ДНК использовали метод щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет) согласно рекомендациям [3], протокол описан в работе [6]. Цельную кровь в соотношении 1:20 смешивали с 1 % легкоплавкой агарозой. Лизис проводили в течение 1 часа при 4ºС в буфере, содержащем 2,5М NaCl, 100мМ Na₂EDTA, 10мМ трис-(гидроксиметил)-аминометан, 10 % диметилсульфоксид, 1 % тритон Х-100 (рН=10). Этап денатурации проводили в течение 20 мин. при 4 ºС в щелочном буфере, содержащем 300мМ NaOH, 1мМ Na₂EDTA (рН>13). В том же буфере проводили электрофорез (4 ºС, 20 мин, 300 мА, 20 В, источник тока Эльф-4 (ДНК-технология), камера BIO-RAD Sub-Cell model 96). Препараты фиксировали в 70º этаноле и окрашивали в растворе этидиум бромида (2 мкг/мл). В качестве позитивного контроля использовали препараты, которые перед этапом лизиса инкубировали в растворе Н₂О₂ (150 мкМ/л) 10 мин. при 4ºС.

Микроскопирование препаратов осуществляли на люминесцентном микроскопе Axio Imager M2, Zeiss. Съемку производили цветной цифровой камерой AxioCam HRc, Zeiss при длине волны возбуждения 520 нм, волны эмиссии – 640 нм, для каждой пробы соблюдали одинаковые разрешение и экспозицию. Определение интенсивности свечения этидиум бромида, связанного с нуклеоидами, и подсчет параметров ДНК-комет проводили с помощью программного обеспечения AxioVision, rel.4.8. На каждом микропрепарате анализировали не менее 200 комет, определяя % ТДНК.

Численные данные анализировали с помощью приложений Exsel и Statistiсa 6.0. Статистическую значимость различий оценивали непараметрическим U-критерием (Манна – Уитни) и параметрическим – Т-тест Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования показали, что в контрольной группе (у здоровых женщин) %ТДНК составлял в среднем 2,8±0,2 %, индивидуальные различия были в пределах от 1,6 до 4,0 % ТДНК (таблица 1). В позитивном контроле (после воздействия Н₂О₂) уровень повреждения ДНК увеличивался в среднем в 5 раз (от 2,6 до 8,6 раз) вне зависимости от количества лейкоцитов в крови.

В группе больных РМЖ до лечения средний уровень % ТДНК не отличался от значения в контрольной группе и составлял 2,6±0,31 % ТДНК (таблица 2). При этом у 11 человек исходный уровень % ТДНК был ниже среднего значения по контрольной группе (1,8±0,06 %), а у 6 человек исходный уровень % ТДНК был выше среднего значения по контрольной группе (4,0±0,45 %) (p<0,001). Только у 2-х человек (№ 14 и 17) исходный уровень % ТДНК превышал максимальный в контрольной группе. У больных РМЖ % ТДНК в позитивном контроле (после воздействия Н₂О₂) увеличивался в среднем также в 5 раз, однако индивидуальный разброс был шире – от 1,8 до 18,2 раз. При этом у больных с уровнем повреждения ниже среднего по контрольной группе % ТДНК в позитивном контроле увеличивался в среднем в 6,2 раза, у больных с уровнем повреждения выше среднего по контрольной группе % ТДНК увеличивался в среднем лишь в 3,2 раза.

Таблица 1

Уровень поврежденности ДНК лейкоцитов и общее количество лейкоцитов крови здоровых женщин

Примечание: Mean – среднее значение, SE – стандартная ошибка.

При оценке динамики уровня % ТДНК в течение 4 суток после введения химиопрепаратов на 1 курсе химиотерапии только у 1 больной было выявлено значимое его увеличение (больная № 14). У остальных больных колебания уровня % ТДНК не были статистически значимы. В позитивном контроле через 1–2 суток после введения химиопрепаратов отмечалось менее выраженное (по сравнению с фоновым контролем) увеличение % ТДНК в ответ на воздействие Н₂О₂, т.е. ослабление реакции на Н₂О₂ – нарастала устойчивость лейкоцитов к окислению ДНК, через 3 суток отмечалось постепенное восстановление исходной реакции клеток, т.е. увеличение чувствительности к повреждению Н₂О₂. Надо отметить, что у всех больных через 1 сутки после введения химиопрепаратов существенно выросло общее количество лейкоцитов в среднем с 5,5×10⁹ кл./л (разброс от 4,0 до 7,1×10⁹ кл./л) до 8,0×10⁹ кл./л, р=0,005 (разброс от 5,2 до 11,3×10⁹ кл./л), что указывает на выход дополнительного количества лейкоцитов из кровяных депо (костного мозга и селезенки) в ответ на цитотоксическое действие химиопрепаратов на клетки крови. В результате происходит обновление популяции лейкоцитов. В последующие сутки этот показатель снижался, приближаясь к значениям до начала лечения.

Перед 2 курсом НАХТ, т.е. через три недели после введения химиопрепаратов на 1 курсе, у 4 женщин (28 % больных) уровень % ТДНК в лейкоцитах был значимо повышен по сравнению с их исходно низким уровнем (перед 1 курсом) – в 3–5 раз (p<0,05), у 1 больной (№ 14) уровень % ТДНК снизился в 3,5 раза (p<0,001), а у 5 больных (№ 9, 10, 11, 15, 17) с исходно более высоким (перед 1 курсом) уровнем % ТДНК произошло снижение этого показателя на 24–54 %, хотя и статистически не значимое. Через 3 суток после введения химиопрепаратов на 2 курсе НАХТ уровень % ТДНК снизился, вернувшись к соответствующим фоновым значениям до 1 курса НАХТ. Динамика реакции лейкоцитов на воздействие Н₂О₂ в позитивном контроле была аналогична изменениям на 1 курсе. Далее нам удалось проследить только 3 больных с высоким уровнем % ТДНК перед 2 курсом НАХТ. На 3 курсе химиотерапии % ТДНК у них оказался значительно сниженным в среднем в 2,2 раза по сравнению с фоном перед 2 курсом, оставаясь, однако, выше исходных значений.

Таблица 2

Уровень поврежденности ДНК (% ТДНК ± SЕ) лейкоцитов крови больных РМЖ в процессе неоадъювантной химиотерапии

Примечание: *– статистически значимое отклонение от показателя до начала 1 курса химиотерапии (p<0,05), ** – статистически значимые различия между подгруппами 1 и 2 (p<0,001). Mean – среднее значение, SE – стандартная ошибка.

По результатам проведенного исследования нельзя однозначно сказать, что больные РМЖ в целом существенно отличаются от здоровых женщин (без выявленной онкопатологии) по уровню поврежденности ДНК лейкоцитов крови. Однако больные РМЖ представляют собой достаточно разнородную группу – у 65 % больных интегральный показатель поврежденности был существенно ниже, а у 35 % – выше среднего по группе здоровых женщин. Это может быть связано с индивидуальными различиями в интенсивности окислительных процессов, протекающих в крови, и состоянии антиоксидантных систем защиты, как плазменных, так и внутриклеточных. Кроме того, %ТДНК как интегральный показатель поврежденности ДНК зависит не только от интенсивности процессов повреждения ДНК, но также и от активности репаративных процессов, протекающих в клетке. Существуют индивидуальные различия в активности систем репарации, определяемые полиморфизмом генов ферментов репарации.

Полученные данные по динамике поврежденности ДНК лейкоцитов в течение 2 курсов НАХТ с использованием в схеме доксорубицина выявили разнородность ответа лейкоцитов больных РМЖ на разных сроках после введения химиопрепаратов. К концу первых суток после инфузии только у одной больной из 10 обследованных на данном этапе было выявлено значительное увеличение поврежденности ДНК. При этом у данной больной с сопутствующим хроническим пиелонефритом был отмечен повышенный исходный уровень поврежденности ДНК, что может свидетельствовать об исходно нарушенном балансе интенсивности окислительных и репаративных процессов. У остальных больных изменения были слабо выражены или отсутствовали. Одной из причин такого явления может быть процесс репопуляции лейкоцитов (выброс более молодых и, возможно, более устойчивых клеток), о чем свидетельствует увеличение количества лейкоцитов у больных через 1 сутки после инфузии химиопрепаратов. Похожая картина наблюдается и на 2 курсе НАХТ.

В данном исследовании нам не удалось выявить четких взаимосвязей между изменением показателя % ТДНК в лейкоцитах и такими клиническими характеристиками, как распространенность опухолевого процесса (классификация по TNM) или биологическим подтипом РМЖ. Однако стоит обратить внимание на существование некоторых клинических особенностей у больных со значимым увеличением % ТДНК перед 2 курсом НАХТ: у больной № 2 (с самым высоким % ТДНК перед 2 курсом) у единственной в группе был обнаружен трижды негативный подтип РМЖ (часто ассоциирующийся с мутацией BRCA1 и характеризующийся агрессивным течением), больная № 3 единственная в группе имела синхронный РМЖ (люминальный В HER2 позитивный подтип), больная № 4 (опухоль люминального В HER2 негативного подтипа) – единственный в группе случай отдаленного метастазирования (в мягкие ткани грудины), у больной №13 выявлена крупная опухоль с мультицентрической формой роста (люминальный В HER2 позитивный подтип), кроме того, состояние больной было осложнено значительно выраженной сердечно-сосудистой патологией.

В литературе имеются сведения об увеличении уровня поврежденности ДНК лейкоцитов больных РМЖ в процессе химиотерапии. Например, Blaziak J. и соавт. [8] изучали выделенные из крови лимфоциты у больных РМЖ до и после химиотерапии по схеме, включающей циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил (CMF). Показано, что больные РМЖ и до лечения и на 8–12 день после инфузии характеризуются более высоким уровнем эндогенного повреждения ДНК, чем здоровые женщины, примерно в 7–10 раз. В исследовании Сироты Н.П. и соавт. [4] изучали уровень повреждения ДНК лейкоцитов цельной капиллярной крови у больных РМЖ в процессе лечения также по схеме CMF, однако отсутствуют данные по уровню повреждения ДНК до начала лечения, к тому же обследованы всего две пациентки на разных курсах химиотерапии. Необходимо обратить внимание на то, что используемый в данной схеме метотрексат подавляет не только синтез ДНК, но и ее репарацию.

В работе Berno C.R. и соавт. [7] методом ДНК-комет был продемонстрирован значительный генотоксический эффект доксорубицина на лейкоциты крови в экспериментах на мышах. Однако использование 4-аминоантипирина (4-Aminoantipyrine, метаболита анальгетического препарата дипирон) в комбинации с химиопрепаратами циклофосфамид, доксорубицин и цисплатин уменьшало проявления их генотоксического эффекта.

Нельзя не учитывать и возможный вклад образовавшихся аддуктов химиопрепаратов (например, доксорубицина, циклофосфамида) с ДНК, которые могут препятствовать расхождению молекул ДНК в процессе электрофореза, как было показано в работе Греховой А.К. и соавт. [2] для цисплатина и морфозола. В пользу этого предположения говорит также ослабление реакции на Н₂О₂ на 1–2 сутки после введения химиопрепаратов. Возможно также, что к концу первых суток после введения химиопрепаратов процесс репарации повреждений ДНК соответствующими системами уже завершен, поэтому необходима оценка поврежденности ДНК на более ранних сроках после введения химиопрепаратов (например, через 1–3 часа). В связи с этим мы выборочно у двух больных исследовали % ТДНК через 1,5 часа после введения доксорубицина на 1 курсе НАХТ (таблица 3).

Таблица 3

Уровень поврежденности ДНК лейкоцитов крови перед НАХТ и на разных сроках после введения доксорубицина

Примечание: * – статистически значимое отклонение от показателя до начала 1 курса химиотерапии (p<0,05). SE – стандартная ошибка.

У больной № 13 значимое изменение показателя было выявлено только перед 2 курсом НАХТ – % ТДНК вырос в 3,5 раза по сравнению с фоновым значением. У больной №14 уже через 1,5 часа после введения доксорубицина % ТДНК был повышен в 2,4 раза по сравнению с фоном до лечения, через 1 сутки после введения трех препаратов % ТДНК оставался повышенным, а через 4 суток оказался выше фонового уровня в 3,3 раза. Однако через 21 сутки (т.е. перед 2 курсом) произошло значительное снижение % ТДНК – в 3,5 раза ниже фонового значения. Изменение уровня % ТДНК в позитивном контроле выявило постепенное ослабление реакции клеток на Н₂О₂: у больной № 13 на всех сроках наблюдения, у больной № 14 реакция клеток на Н₂О₂ также снижалась до 4 суток после введения доксорубицина, но затем она восстанавливалась и к началу 2 курса НАХТ стала в 4 раза более сильной, чем исходно.

Полученные результаты показали различную динамику показателя % ТДНК лейкоцитов у разных больных. Такая картина может складываться в результате взаимодействия многих факторов – особенностей связывания доксорубицина в крови с эритроцитами, плазматическими факторами, с особенностями работы мембранных механизмов транспорта, различиями в работе внутриклеточных метаболических систем, различиями в активности систем репарации ДНК, а также в результате возможного влияния других препаратов, вводимых онкологическим больным в процессе их лечения.

Заключение

Полученные нами результаты показали более низкий ответ лейкоцитов периферической крови обследованных больных РМЖ по сравнению с данными литературы, полученными при химиотерапии с использованием метотрексата и при исследовании действия доксорубицина на животных [4,7,8]. Динамика поврежденности ДНК лейкоцитов в процессе неоадъювантной химиотерапии с использованием в схеме доксорубицина показала, что существует индивидуальная вариабельность показателя % ТДНК, которая может отражать изменения в чувствительности лейкоцитов к цитотоксическому воздействию химиопрепаратов, обусловленные активностью транспортных механизмов, состоянием внутриклеточных систем метаболизма, активностью механизмов защиты ДНК (состояние хроматина, репаративные системы). Результаты исследования позволяют предполагать, что различия в ответе лейкоцитов при использовании метода ДНК-комет для оценки поврежденности ДНК могут быть связаны со спецификой используемых в онкологии химиопрепаратов. Необходимы дальнейшие исследования динамики поврежденности ДНК неопухолевых (нетаргетных) клеток, особенно в первые часы после введения химиопрепаратов.