Оренбургская область, обладая крупным многоотраслевым промышленным и топливно-энергетическим комплексом, занимает одно из первых мест среди регионов России по загрязнению окружающей природной среды [1]. Особенно эта проблема актуальна для восточной части Оренбургской области. Деятельность предприятий электроэнергетики, добычи и переработки минерального сырья, черной и цветной металлургии, нефтепереработки приводит к загрязнению вредными веществами атмосферного воздуха, почвенного покрова, поверхностных водных объектов с образованием геохимических аномалий техногенного характера.

В природе существуют различные механизмы устойчивости к воздействию неблагоприятных факторов, так, например, представители рода Ascophyllum свободно адсорбируют свинец и кадмий, которые накапливают эти металлы в количестве больше, чем 30 % от веса сухой биомассы [2]. Такой запас чаще всего является способом детоксикации, защиты от неблагоприятных концентраций ионов тяжелых металлов, которые оказывают на организмы токсичное воздействие.

Так, например, токсичное действие кадмия проявляется в ингибировании синтеза ДНК, белков и нуклеиновых кислот, в изменении активности ферментов, нарушении усвоения и обмен других микроэлементов, что может вызывать их дефицит [3].

В природных условиях встречается большое количество микроорганизмов, которые адсорбируют от 30 до 40 процентов ионов тяжелых металлов на своей поверхности.

Интерес к микроорганизмам рода Bacillus в отношении их способности к накоплению ионов тяжелых металлов возник в связи с данными, которые были получены на кафедре микробиологии Университета Порт-Харкорт в Нигерии, где были проведены исследования по изучению аккумуляции кадмия бактериями рода Bacillus, которые использовались в качестве сорбентов кадмия в речной воде с целью их очистки. По результатам исследований доля накопления исследуемого металлов после 24 часов воздействия составила до 71,6 % [4].

В связи с этим целью нашего исследования явилось: изучение способности к аккумуляции тяжелых металлов пробиотическими штаммами микроорганизмов в условиях in vitro и in vivo

Исходя из поставленной цели, нами были определены следующие задачи:

1) оценить уровень загрязненности кадмием различных районов Оренбургской области по средству определения концентрации исследуемого металла в тканях сельскохозяйственных животных;

2) определить минимальные подавляющие концентрации кадмия на рост бактерий в периодической культуре, его влияние на динамику роста исследуемых микроорганизмов и оценить способность исследуемых пробиотических штаммов в условиях in vitro;

3) изучить эффективность применения пробиотических штаммов исследуемых микроорганизмов при интоксикации кадмием по средству изучения биохимических показателей крови и способности спорообразующих бактерий рода Bacillus к накоплению кадмия по средству определения концентрации тяжёлых металлов в тканях лабораторных животных.

Объекты и методы исследования. На первом этапе в качестве объектов исследования были отобраны образцы тканей сельскохозяйственных животных из районов, которые расположены в Центральном и Восточном Оренбуржье. К ним относятся Сакмарский, Соль-Илецкий, Сорочинский, Кваркенский и Светлинский районы.

Определение содержания кадмия в исследуемых объектах проводили по стандартизированным методикам в аккредитованной лаборатории Испытательного Центра ГНУ «Всероссийский НИИ мясного скотоводства» РАСХН (аттестат аккредитации И.Л. NPOOCRU 000121 ПФ 59) методом атомно-абсорбционной спектрофотомерии [5, 6].

На втором этапе исследования нами оценивалась биоаккумулирующая способность ионов кадмия микроорганизмами, входящими в состав пробиотических препаратов.

В работе использовались 3 пробиотических препарата: «Ветом 2» на основе B. subtilis ВКПМ В 7048 и B. licheniformis ВКПМ В 7038, «Споробактерин жидкий» – B.subtilis 534, и «Бактисубтил» на основе B.cereus IP 5832. В качестве регулирующего фактора в работе использовали CdSO₄ × 8H₂O – восьмиводный сульфат кадмия.

Для реализации поставленной цели нами использовались атомно-абсорбционный метод и методы биохимического исследования крови [7, 8].

Результаты и их обсуждение

На первом этапе исследования нами определялся уровень загрязненности кадмием районов Оренбургской области по средству изучения биосубстратов сельскохозяйственных животных в различных районах Оренбургской области (таблица 1).

Таблица 1

Содержание кадмия в биосубстратах животных из разных районов Оренбургской области, мг/г

Представленные данные свидетельствуют, что максимальный уровень загрязненности кадмием зарегистрирован в Кваркенском районе, при этом максимальной биоаккумулирующей способностью обладают почки и печень исследуемых животных.

Для решения второй и третьей задач нами использовались следующие методы: выделения чистых культур, последовательного разведения, фотоэлектроколориметрический и атомно-адсорбционный [7]. Биохимические (сахар, холестерин, мочевина, общий белок, аланинацилтрансфераза, билирубин, креатинин, щелочная фосфотаза) показатели крови исследовались в соответствии с общепринятыми методиками [8].

Относительно значений накопления ионов кадмия, в соответствии с данными, представленными на рисунке 1, можно отметить, что они намного ниже, чем значения накопления остальных металлов, и штаммовых различий не наблюдается.

Так, содержание ионов кадмия в биомассе B.subtilis 534 и B.subtilis ВКПМ В 7048 составляет 5,68 и 4,93 процента, а в биомассе B.cereus IP 5832 и B.licheniformis ВКПМ В 7043 4,3 и 3,88 процента соответственно.

Рис. 1. Содержание кадмия в биомассе бактерий рода Bacillus и в супернатате

Одним из факторов оценки эффективности применения пробиотических препаратов при интоксикации тяжелыми металлами являлась определение колониеобразующих единиц (КОЕ) исследуемых микроорганизмов в крови и фекалиях (рисунок 2, 3) экспериментальных животных.

В ходе проведенных исследований нами было установлено, что во всех опытных группах и группах контроля пробиотических препаратов на протяжении всего эксперимента регистрируется увеличение КОЕ с пиком значений к 21.

Близкая по значению тенденция зарегистрирована при определении КОЕ пробиотических штаммов в фекалиях исследуемых животных.

Рис. 2. Динамика КОЕ исследуемых микроорганизмов в крови лабораторных животных при интоксикации кадмием

Рис. 3. Динамика КОЕ исследуемых микроорганизмов в фекалиях лабораторных животных при интоксикации кадмием

Биохимическое исследование сыворотки крови экспериментальных животных позволяет оценить как степень влияния ксенобиотиков на метаболические процессы, так и наличие патологических изменений со стороны внутренних органов, в частности наличие возможных дегенератических изменений со стороны органов, отвечающих за детоксикацию (печень, селезенка). Исходя из вышеизложенного, следует, что наиболее показательными являются общий билирубин, АлАТ и щелочная фосфатаза.

Как известно, билирубин является одним из промежуточных продуктов распада гемоглобина, происходящего в макрофагах селезёнки, печени и костном мозге. Он образуется путём ферментативного восстановления биливердина. Исходя их этих данных, можно предположить, что повышение концентрации этого показателя крови может свидетельствовать о токсическом повреждении печени (рисунок 4).

В случае с интоксикацией кадмием картина динамики не выглядит столь однозначно. Содержание билирубина в опытных группах на протяжении всего эксперимента имело более высокие значения, как в отношении группы общего контроля, так и в отношении группы контроля интоксикации кадмием. С сохранением тенденции к увеличению в группе, где применялся «Споробактерин». В то время как в группе, где в качестве лекарственного препарата применялся «Ветом 2», на заключительном этапе исследования уровень билирубина имел более низкие значения по сравнению с группой К0.

Рис. 4. Динамика изменения концентрации общего билирубина в крови лабораторных животных при интоксикации кадмием

Анализ динамики АлАТ, как и в случае с общим билирубином имеет идентичную закономерность к увеличению данного показателя на 7 день эксперимента, однако следует отметить, что в опытных группах его концентрация была ниже контрольного значения (К1) с последующей нормализацией к 21 дню эксперимента до уровня физиологической нормы.

Щелочная фосфатаза участвует в обмене фосфорной кислоты, расщепляя ее от органических соединений и способствуя транспорту фосфора в организме. У человека щелочная фосфатаза представлена во всех тканях, особенно высокая концентрация в печени, желчном протоке, почках, костях и плаценте. Её повышение может свидетельствовать о патологии печени (рисунок 5).

Представленные на графике данные подтверждают наши предположения о развитии токсического эффекта при интоксикации свинцом, причем фаза обострения регистрируется на 7 день эксперимента. Однако в опытных группах значения данного показателя, как и ряда других проанализированных показателей, снижается к финалу эксперимента.

Рис. 5. Динамика изменения концентрации щелочной фосфатазы в крови лабораторных животных при интоксикации свинцом

Оценка биоаккумулирующей способности на модели in vivo оценивалась путем определения кадмия в мышечной и костной тканях, а также кожном покрове. Количество кадмия в мышечной ткани лабораторных животных на 7 день исследования в опытных группах (О4, О5, О6) превышало значения К0 на 89; 61 и 84 процента соответственно, однако, уровень показателей оказался ниже значений группы К1, в группе О4 на 17; О5 на 10 и О6 на 7 процентов. После 14 дня эксперимента содержания кадмия уменьшилось по сравнению с опытными группами 21 дня в О4 на 25; О5 на 6 и О3 на 11 процентов, соответственно. Как и при выведении кадмия из костной ткани к 21 дню эксперимента наблюдается уменьшение количества выведенного кадмия из мышечной ткани, при этом на 21 день эксперимента по сравнению с 14 днем содержание кадмия уменьшилось в опытных группах на 6; 7 и 7 процентов соответственно. К 21 дню К1 превышает показатели опытных групп на 40 процентов для О4, на 43 – О5 и 20 процентов для О6.

Аналогичная динамика изменения концентрации ионов кадмия наблюдалась при исследовании костной ткани и кожном покрове. В таблице 2 представлены суммарные значения выведения кадмия в опытных группах на 21 день эксперимента в сравнении с группой К1 (интоксикация кадмием).

Таблица 2

Сравнительный анализ биоаккумуляции пробиотических штаммов в условиях in vivo и in vitro

Таким образом, в результате первой серии эксперимента было установлено, что у животных, разведение которых осуществляется в районах, расположенных в непосредственной близости с Челябинской областью (Кваркенский и Светлинский), наблюдается повышенное содержание кадмия в организме.

Во второй серии эксперимента было установлено, что применение пробиотических препаратов позволяет существенно снизить уровень ксенобиотической нагрузки на организм животных. Так, применение препаратов на основе бактерий рода Bacillus снижает уровень кадмия в тканях лабораторных животных в среднем более чем на 50 %, при этом наиболее эффективным препаратом является «Споробактерин».