При стрессе различного генеза, а также при старении в организме наблюдается значительное усиление свободнорадикальных процессов [7]. Свободные радикалы вызывают повреждение наследственного материала, мембранных структур и др. Изучение процессов липидной пероксидации наиболее актуально для тканей головного мозга, содержащих более 40% липидов. Повышенная чувствительность нервной ткани обусловлена высокой степенью метаболических процессов, насыщенностью кислородом, низкой активностью каталаз, увеличением фракции полиненасыщенных жирных кислот [6]. Развитие окислительного стресса сопровождается снижением концентрации α-токоферола, нивелирующего действие свободных радикалов, в том числе стабилизацией биомембран [4], создаются условия для повышения окислительной деструкции белков, липидов, особенно у стареющих организмов [5].

Цель. Целью исследования явилось изучение динамики свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови: конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) и промежуточных продуктов ПОЛ (ацетилгидроперекисей диеновых конъюгатов, кетодиенов, сопряженных триенов) и в тканях головного мозга - МДА при стрессогенном воздействии и при фармакологической коррекции (введение α-токоферол-ацетата, циклоферона) у половозрелых крыс.

α-Токоферол является природным антиоксидантом, способен разрушать активные метаболиты кислорода, участвует в защите липопротеинов сыворотки крови, стабилизирует структуру цитолеммы, связывает продукты гидролиза фосфолипидов, на генном уровне осуществляет коррекцию апоптоза [4].

Согласно современным данным, циклоферон обуславливает стимуляцию выработки эндогенного интерферона, влияет на продукцию других цитокинов (фактор некроза опухоли, интерлейкины), модулирует уровень программмированной клеточной гибели [8].

Материалы и методы

В эксперименте было использовано 64 белых беспородных старых крыс-самцов (30 мес), средней массой 352 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном световом освещении и свободном доступе к воде и пище.

В опыте использованы следующие группы.

1. Интактные крысы (контроль) (n = 8).

2. Крысы, получавшие масляный 10%-ный раствор α-токоферол-ацетата per os, в течение двух недель, в дозе 0,5 мг на 100 г массы тела (n = 8).

3. Крысы, получавшие циклоферон (Полисан СПб) per os, в течение двух недель, 1,19 мг на 100 г массы тела (n = 8).

4. Крысы, получавшие совместно 10%-ный масляный раствор α-токоферол-ацетата (0,5 мг на 100 г) и циклоферон per os (1,19 мг на 100 г массы тела) в течение двух недель (n = 8).

5. Крысы, подвергшиеся иммобилизационному стрессу в пластиковых цилиндрах по 1 часу в день в течение двух недель (n = 8).

6. Стрессированные крысы, получавшие предварительно 10%-ный масляный раствор α-токоферол-ацетата в тех же дозах в течение двух недель (n = 8).

7. Стрессированные крысы, получавшие предварительно циклоферон в тех же дозах в течение двух недель (n = 8).

8. Стрессированные крысы, получавшие предварительно раствор α-токоферол-ацетата и циклоферон тех же дозах в течение двух недель (n = 8).

По окончании воздействий на следующий день проводили декапитацию животных.

Определение динамики процессов ПОЛ в гомогенатах тканей головного мозга (по методу И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили (1977) в модификации Е.А. Строева и В.Г. Макаровой (1986) [3].

Метод основан на реакции одного из конечных продуктов - малонового диальдегида (МДА) - с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм.

Экстинкцию всех проб измеряли на спектрофотометре (светофильтр зеленый, длина волны 532 нм) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Единицы измерения в методике определения скорости ПОЛ - нмоль/час, для определения уровня МДА - нмоль/500 мг ткани.

Определение уровня свободнорадикального окисления липидов в плазме крови

Для оценки уровня ПОЛ у животных контрольной и опытных групп определяли исходную концентрацию вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида в плазме крови тиобарбитуровым методом [2; 3].

Высчитывали среднюю величину содержания ТБК - активных продуктов на одного животного и далее на группу.

Определение уровня промежуточных продуктов перекисного окисления липидов (ПП ПОЛ)

(по методу Волчегорского В.А. и соавторов (1989)) [1].

Интенсивность образования промежуточных продуктов ПОЛ с изолированными двойными связями (220 нм), диеновых коньюгатов (232 нм), кетодиенов и сопряженных триенов (278 нм) спектрофотометрически определяли в изопропанольной и гептановой фракции.

Принцип метода основан на интенсивном поглощении конъюгированных диеновых структур в области 232-234 нм.

Полученные экспериментальные данные обработаны с использованием пакета статистических программ Microsoft Excel. Сравнение средних показателей производили с помощью стандартных методов вариационной статистики. Различия в показателях считались статистически значимыми при уровне р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследование процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенатах тканей головного мозга показало (табл. 1), что при введении α-токоферол-ацетата скорость спонтанного ПОЛ снижается на 11,8%, количество МДА уменьшается на 25,6% по сравнению с контрольной группой. При введении циклоферона также наблюдается снижение скорости спонтанного ПОЛ на 13,9%, количество МДА на 20,3%.

Таблица 1

Показатели динамики процессов ПОЛ в гомогенатах тканей головного мозга

		Скорость спонт. ПОЛ нмоль/ч	Скорость АСК-ПОЛ нмоль/ч	Количество МДА нмоль/500 мг ткани
1	Контроль	11,17+/- 0,3	88,41 +/- 1,8	1,68+/-0,12
2	Токоферол	9,88 +/- 0,4***	79,17 +/- 1,9***	1,25 +/- 0,1***
3	Циклоферон	9,62 +/- 0,4***	82,27 +/- 2,4**	1,34 +/- 0,09**
4	Токоферол + Циклоферон	8,43 +/- 0,6***	76,84+/- 2,6***	1,22 +/- 0,11***
5	Стресс	13,61 +/- 0,76***	99,81 +/- 2,1***	2,45 +/- 0,24***
6	Стресс + Токоферол	10,65+/- 0,5*000	81,87+/-1,9**000	1,52 +/- 0,10*000
7	Стресс + Циклоферон	8,95+/-0,82***000	76,22+/-2,3***000	1,54 +/- 0,09*000
8	Стресс + Токоферол + Циклоферон	8,21+/-0,57***000	74,08+/-2,2***000	1,49 +/- 0,10*000

Примечание. Статистическая значимость с группой «Контроль»: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001.

Статистическая значимость с группой «Стресс»: ⁰-p < 0,05; ⁰⁰ -p < 0,01; ⁰⁰⁰ - p < 0,001.

При комбинированном воздействии α-токоферол-ацетата с циклофероном скорость спонтанного ПОЛ снизилась на 24,5%, скорость АСК-зависимого ПОЛ - на 13,2% и количество МДА - на 27,4%, что отразило большую активность совместного действия препаратов. Иммобилизационный стресс старых животных привел к увеличению показателей ПОЛ: скорость спонтанного ПОЛ увеличилась на 22,0%, скорость АСК-зависимого ПОЛ на 13,1%, а также значительно повысилось количество МДА - на 45,8% по сравнению с контролем. Действие α -токоферол-ацетата у стрессированной группы вызвало снижение скорости спонтанного ПОЛ на 21,7%, АСК-зависимого ПОЛ на 18,1%, количества МДА на 28,6%. Отмечена динамика снижения показателей при введении циклоферона у стрессированных животных: скорость спонтанного ПОЛ - на 20,4%, АСК-зависимого ПОЛ - на 26,4%, количества МДА на 38,3% - по сравнению с интактными стрессированными животными. Циклоферон на стрессированных животных повлиял следующим образом: скорость спонтанного ПОЛ снизилась на 34,6%, АСК-зависимого ПОЛ - на 23,6% и МДА - на 37,2%, по сравнению со стрессированной группой.

Введение комплекса α-токоферол-ацетата и циклоферона стрессированным старым крысам снизило скорость спонтанного ПОЛ на 34,2%, АСК-зависимого ПОЛ (26,1%) и количество МДА (39,2%) по сравнению с интактной стрессированной группой, а также привело к снижению показателей по сравнению с контрольной группой, находящейся в покое: скорость спонтанного ПОЛ снизилась на 20,1%, АСК-ПОЛ - на 15,3%, количество МДА - на 11,3%.

Изменение концентрации МДА в плазме крови

При определении количества малонового диальдегида было выявлено изменение содержания липидных перекисей в плазме крови у экспериментальных 30-месячных крыс (табл. 2).

Таблица 2

Показатели конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в плазме крови старых крыс

	Группы животных	Количество МДА, мкмоль/л
1	Контроль	1,94 +/- 0,12
2	Токоферол	1,43 +/- 0,08***
3	Циклоферон	1,43 +/- 0,09***
4	Токоферол + Циклоферон	1,44 +/- 0,06***
5	Стресс	3,79 +/- 0,1***
6	Стресс + Токоферол	1,64+/- 0,09*000
7	Стресс + Циклоферон	1,53 +/- 0,14*000
8	Стресс + Токоферол + Циклоферон	1,61+/- 0,12*000

Примечание. Статистическая значимость с группой «Контроль»: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001.

Статистическая значимость с группой «Стресс»: ⁰-p < 0,05; ⁰⁰ -p < 0,01; ⁰⁰⁰ - p < 0,001.

Действие α-токоферола на контрольную группу крыс, находящихся в покое, привело к снижению концентрации МДА в плазме на 26,3% по сравнению с контрольной группой. Циклоферон снизил данный показатель на 26,4%. Сочетание токоферола с циклофероном привело к снижению количества МДА - на 25,8%. У крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу, количество малонового диальдегида увеличилось на 95,4% по сравнению с контролем. Фармакологическая коррекция α-токоферол-ацетатом снизила данный показатель на 56,7%, циклофероном - на 59,6%, а сочетанное их действие привело к снижению количества МДА на 57,6%. Также следует отметить, что действие этих препаратов снизило показатели МДА по сравнению с контролем: α-токоферол на 15,5%; циклоферон на 19,6%; их совместное действие - на 17,0%.

Определение промежуточных продуктов ПОЛ в плазме крови - ацетилгидроперекисей, диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов

Наибольшее снижение количества диеновых конъюгатов было выявлено при введении α-токоферола и сочетании α-токоферола с циклофероном у крыс, находящихся в покое - 46,7%. (табл. 3).

Таблица 3

Показатели промежуточных продуктов ПОЛ в плазме

	Группы животных	Ацетилгидро-перекиси (ед. оптической плотности)	Диеновые конъюгаты (ед. оптической плотности)	Кетодиены и сопряженные триены (ед. оптической плотности)
1	Контроль	0,48 +/- 0,04	0,15 +/- 0,03	0,083 +/- 0,004
2	Токоферол	0,32 +/- 0,06**	0,08+/- 0,02*	0,070 +/- 0,004*
3	Циклоферон	0,35 +/- 0,04***	0,10 +/- 0,02*	0,073 +/- 0,003*
4	Токоферол + Циклоферон	0,33 +/- 0,04***	0,08 +/- 0,03*	0,070 +/- 0,006*
5	Стресс	0,67 +/- 0,08 ***	0,21 +/- 0,06***	0,116 +/- 0,007 ***
6	Стресс + Токоферол	0,29 +/- 0,07***000	0,125 +/- 0,04*0	0,072 +/-0,006 *000
7	Стресс + Циклоферон	0,34 +/- 0,05**000	0,12 +/- 0,05*0	0,078+/- 0,005 *000
8	Стресс + Токоферол + Циклоферон	0,33 +/- 0,06*000	0,10 +/- 0,06*0	0,069 +/- 0,006*000

Примечание. Статистическая значимость с группой «Контроль»: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001.

Статистическая значимость с группой «Стресс»: ⁰-p < 0,05; ⁰⁰ -p < 0,01; ⁰⁰⁰ - p < 0,001.

Значительное изменение показателей промежуточных продуктов ПОЛ наблюдали у стрессированной группы - увеличение ацетилгидроперекисей в ед. опт. плотности на 60,4%, диеновых конъюгатов и кетодиенов почти на 40% (табл. 3).

Воздействие α-токоферол-ацетата на стрессированную группу снизило показатели ацетилгидроперекисей на 56,7%, а диеновых конъюгатов - 40,5%. Действие циклоферона также привело к снижению данных показателей. Комбинация α-токоферола и циклоферона снизила количество ацетилгидроперекисей на 50,7%, диеновых конъюгатов - на 52% и кетодиенов и сопряженных триенов - на 40,5%.

Заключение

Полученные нами результаты - повышение интенсивности перекисного окисления липидов у стрессированных старых организмов - отражают общую тенденцию липидной пероксидации во всем организме, в том числе головном мозге. Иммобилизационный стресс старых животных привел к значительному увеличению показателей ПОЛ - значительно повысилось количество МДА - на 45,8% по сравнению с контролем. У крыс, находящихся в покое, и стрессированных иммобилизацией крыс, получавших α-токоферол, циклоферон и их комбинацию, было достоверно обнаружено снижение скорости спонтанного ПОЛ, АСК-зависимого ПОЛ, уровня МДА в гомогенатах тканей головного мозга и плазме крови, а также промежуточных продуктов ПОЛ - ацетилгидроперекисей, диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов.

Рецензенты:

Зурнаджан С.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой оперативной хирургии и топографической анатомии ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Астрахань;

Фельдман Б.В., д.б.н., заведующий кафедрой биологии и ботаники ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Астрахань.