Лазерная медицина как прогрессивное направление медицинской науки наиболее точно оценила свое предназначение для экспериментальных исследований [1, 2, 3, 5]. Антиинфекционные механизмы действия НИЛИ отмечены во многих исследованиях [2, 7]. В литературе имеются единичные сообщения о применении наночастиц в экспериментальной хирургии [2, 6]. При изучении антимикробного влияния наночастиц меди на грамотрицательные микроорганизмы установлено, что наибольшими свойствами обладает суспензия наночастиц меди при концентрации 1 мг/мл. Тем не менее, многие наночастицы токсичны и представляют потенциальную опасность для организма [8, 9]. Однако, работ, оценивающих сочетанную антиинфекционную активность НИЛИ и наночастиц металлов в экспериментах исследованиях до настоящего времени не проводилось.

Цель исследования: изучить выраженность антимикробного действия наночастиц меди, лазерного излучения и их сочетанного применения в эксперименте in vitrо. Задачи исследования: Определить влияние НИЛИ на культуры микроорганизмов; определить выраженность антибактериального эффекта различных концентраций наночастиц меди на культуры микроорганизмов (минимально ингибирующая концентрация); изучить антибактериальные свойства наночастиц меди различных концентраций под действием лазерного излучения.

Материал и методы

Ультрадисперсный порошок меди получали термолизом в токе оксида углерода оксалата меди. Последний синтезировали из ацетата меди и щавелевой кислоты. Таким способом удаётся получить ультрадисперсный порошок меди, состоящий из её кластеров, включающих фрагменты от 60 до 80 нм, и обладающих повышенной устойчивостью на воздухе. В ходе проведенного эксперимента проведено 256 исследований направленных на подбор дозировок и способов применения нанопорошка меди. Оптимальной признана дозировка 0,2 мл в концентрации 1000,100,10 мкг/мл в виде суспензии. Наночастицы меди помещали в стерильные пробирки известной массы для удобства дальнейшего получения стерильных суспензий заданных концентраций. В результате проведенных 52 исследований с применением лазерного аппаратом АЛТ «Матрикс», тип МЛО1КР нами определены параметры, пригодные для его использования, как изолированно, так и в сочетании с нанопорошком меди: частота – 80 Гц, мощность излучения – 15 мВт, длина волны – 630 нм.

Исследование антибактериального действия сочетанного применения наночастиц меди и НИЛИ. Выраженность антимикробного действия синтезированных наночастиц меди и НИЛИ в отношении Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus оценивали бактериологичесикми методами. Использовали стандартизированную по оптическому стандарту мутности МакФарланда суспензию микроорганизмов, полученную смешением суточных культур Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus (по 9*108 КОЕ/мл). Полученную суспензию поэтапно разводили стерильным физиологическим раствором до концентрации 3*105 КОЕ/мл.

В первой серии экспериментов культуру микроорганизмов облучали две минуты аппаратом «Матрикс» в режиме: частота – 80 Гц, мощность излучения – 15 мВт, длина волны – 0,65 мкм, время облучения – 2 минуты. Во второй серии в культуру микроорганизмов вносили по 0,2 мл суспензии нанопорошков меди с конечными концентрациями 1000, 100, 10 мкг/мл. В третьей серии сочетали облучение лазером и внесение наночастиц меди. Контролем служила культура микроорганизмов без воздействий и добавок. Сразу и через 1, 2, 3 часа культивирования производили мерный высев (по 0,1 мл) на чашки с мясо-пептонным агаром и через 24 часа инкубации при 370С в условиях перемешивания (50 оборотов в минуту) подсчитывали количество выросших колоний. При проведении статистической обработки руководствовались методикой определения среднего квадратичного отклонения найденных в опыте значений, предложенной И.П. Ашмариным и А.А. Воробьевым [4].

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что на первом этапе исследования полученные количества выросших колоний сразу после посева существенно не отличались от контроля.

Эксперимент 1-й серии. Через 1 и 2 часа культивирования после лазерного облучения отмечалось снижение количества колоний опытного штамма до (M±s) 199±10 и 1212±35 (p<0,05), соответственно, однако, на третьем часе рост Staphylococcus aureus возобновлялся (рис. 1).

Рис. 1. Количество колоний в зависимости от времени высева после воздействия НИЛИ

Таким образом, эффективность действия лазера констатирована только в течение одного часа, а антибактериальные свойства изолированного НИЛИ признаны недостаточно эффективными.

Эксперимент 2-й серии. Через 24 часа инкубации при 370С высеянных на чашки Петри микроорганизмов, предварительно культивированных 1 час в присутствии ультрадисперсного порошка меди, отмечалось достоверное снижение количества колоний до (M±s) 423±20; 1540±39 и 2446±50 (p<0,05), соответственно, по сравнению с контролем, где отмечался рост в виде газона (сплошной рост). Подобная тенденция сохранялась через 2 и 3 часа культивирования. Нанопорошок меди в концентрации 1 мкг/мл не оказывал влияния на рост опытных культур. Таким образом, в ходе исследования было показано, что опытные концентрации нанопорошков меди (1000 – 10 мкг/мл) вызывают резкое сокращение количества микробных клеток Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus уже в первые часы контакта с культурой при полном подавлении роста через 3 часа воздействия.

Третья серия экспериментов. Сочетание лазерного облучения с опытными концентрациями нанопорошков 1, 100 и 10 мкг/мл через 1 час культивирования привело к еще большему снижению количества клеток до (M±s) 34±6; 125±11 и 2267±48 с последующим отсутствием колоний уже на 2 часу культивирования в 1000 и 100 мкг нанопорошка меди. Через 3 часа рост отсутствовал в концентрациях нанопорошка 1000, 100 и 10 мкг/мл, как при воздействии облучения, так и без него (рис. 2).

Рис. 2. Количество колоний в зависимости от времени высева после сочетанного воздействия НИЛИ и наномеди

Заключение. Установлено, что имеется позитивный потенциал антиинфекционного применения наночастиц меди, особенно при их сочетанном применении с НИЛИ. Нами установлены параметры применения НИЛИ, в ходе проведенных экспериментов были синтезированы и дозированы наночастицы, способные быть использованными в эксперименте. Полученные результаты свидетельствуют, что изолированное применение НИЛИ не обладает достаточно эффективным антибактериальным действием. При оценке результата второй серии эксперимента установлено, что опытные концентрации нанопорошков меди (1000 – 10 мкг/мл) вызывают резкое сокращение количества микробных клеток Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus уже в первые часы контакта с культурой при полном подавлении роста через 3 часа воздействия.

В итоге эксперимента выявлен синергизм антимикробного действия сочетанного использования наночастиц меди и низкоинтенсивного лазерного излучения при воздействии на культуры Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, что позволяет получать антибактериальный эффект при более низких (менее 1 мкг/мл) концентрациях наночастиц меди, снижая тем самым возможное токсическое действие данного вещества на организм в условиях in vivo.

Рецензенты:

Громов М.С., д.м.н., профессор, ректор НОУ ВПО Медицинский институт «Реавиз» Саратовский филиал, г. Саратов.

Капралов С.В., д.м.н., заведующий 1-м хирургическим отделением, МУЗ «Городская клиническая больница № 2 им. В. И. Разумовского», г. Саратов.