Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ МЕТАБОЛИТОВ МОНООКСИДА АЗОТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ И ТКАНИ МОЗГА БЕЛЫХ КРЫС

Мажитова М.В. 1
1 ГОУ ВПО Астраханский государственный университет, Астрахань, Россия
Исследована возможность спектрофотометрического определения уровня метаболитов NO в плазме крови и ткани мозга белых крыс. Определен уровень NO-метаболитов в плазме крови и разных отделах центральной нервной системы животных разного пола двух возрастных групп. Полученные результаты свидетельствуют о половых и возрастных особенностях уровня NO-метаболитов в плазме крови и ткани мозга лабораторных животных. Наиболее ярко половые различия выражены у молодых животных. С возрастом уровень NO-метаболитов у самцов и самок белых крыс изменяется неодинаково. Показано, что модифицированная методика с применением реактива Грисса с одновременным восстановлением нитратов до нитритов хлоридом ванадия (III) дает воспроизводимые результаты не только при исследовании сыворотки крови, но и плазмы крови, а также ткани мозга.
NO-метаболиты
спектрофотометрия
плазма крови
мозг.
1. Ахметов, Н.С. Общая и неорганическая химия: учебник для ВУЗов. – М.,2001.
2. Булатов, М.И. Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа [Текст] / М.И. Булатов, И.П. Калинкин. – Л.: Химия, 1976. – 250 с.
3. Меньщикова, Е. Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е. Б. Меньщикова, В. З. Ланкин, Н. К. Зенков, И. А. Бондарь, Н. Ф. Круговых, В. А. Труфакин. – М.: Фирма «Слово», 2006. – 556 с.
4. Метельская, В. А. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке [Текст] / В. А. Метельская, Н.Г. Гуманова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2005. – № 6. – С. 15–18.
5. Семячкина-Глушковская, О. В. Роль половых гормонов в регуляции базальной и стрессорной секреции оксида азота у крыс / О. В. Семячкина-Глушковская, Т. Г. Анищенко, Т. А. Синдякова, В. А. Бердникова, О. П. Епифанова // Астрах. мед. журнал. Т.3. - № 3. – 2008. – С.130–133.
Оксид азота NO рассматривается как устойчивый свободный радикал. NO - эндотермическое соединение со стандартной теплотой образования ∆Н˚298 = 90,4 кДж/моль. Стандартный изобарный потенциал образования ∆G˚298 также имеет положительное значение (90 кДж/моль). Молекула NO парамагнитна. Согласно методу молекулярных орбиталей, в NO один из электронов находится на πр разр - орбитали: (σscв)2 sразр)2 рcв)4 хcв)2 рразр)1, т.е. порядок связи в NO составляет 2,5 [1]. Будучи липофильным соединением не имеющим заряда, NO легко диффундирует в биологических средах и является достаточно долгоживущим: среднее время жизни в биологических тканях 5,6 с [3]. NO имеет огромное физиологическое значение, однако его молекула может реагировать с другими свободными радикалами. Энергия ионизации NO составляет 9,3 эв, следовательно молекула NO может терять непарный электрон с πрразр - ­­­­­­­­­­орбитали, образуя нитрозил (нитрозоний) - ион NO+. Также NO может выступать как окислитель и присоединять электрон с образованием неустойчивого аниона NO-. Учитывая возможность окислительно-восстановительных реакций с участием молекулы NO и ее производных, при неблагоприятных условиях метаболизма может возникнуть нитрозилирующий стресс. Поэтому контроль за уровнем NO-метаболитов является актуальной задачей биохимии. Ранее В. А. Метельской, Н.Г. Гумановой (2005) [4] была описана методика определения уровня NO-метаболитов в сыворотке крови с применением прибора «Labsystems Vultiskan MCC/340» по принципу вертикального фотометрирования. Определенно, наличие такого оборудования облегчает и ускоряет проведение анализа, однако очень часто лаборатории оснащены другими, менее современными приборами, что диктует поиск модифицированных методик определения NO-метаболитов в разных тканях.

Вышесказанное определило цель нашей работы - исследовать возможность спектрофотометрического определения уровня NO-метаболитов в плазме крови и ткани мозга белых крыс разного пола и возраста с применением спектрофотометра марки ПЭ 5400В или его аналогов.

Материалы и методы. Для достижения поставленных целей нами был использован спектрофотометрический метод определения нитрит-иона [4], основанный на реакции нитритов с реактивов Грисса, который представляет собой смесь равных объёмов водного раствора 0,05 % N-нафтилэтилендиамина и 1 ­% раствора сульфаниламида в уксусной кислоте. Данный метод количественного определения нитрит-ионов основан на способности первичных ароматических аминов в присутствии азотистой кислоты образовывать интенсивно окрашенные диазосоединения.

Максимум полосы поглощения образующегося соединения лежит при λ 540 нм. Поскольку реактив Грисса, с помощью которого проводятся определения, позволяет детектировать только нитрит-ион, необходимым условием анализа является перевод нитрата в нитриты, что достигается взаимодействием нитрат-ионов с хлоридом ванадия (III). Одновременно в реакционной среде протекает реакция диазотирования сульфаниламида образовавшимся нитритом с последующим развитием розовой окраски, интенсивность которой определяется спектрофотометрически. Учитывая, что хлорид ванадия (III) - лёгкий, летучий порошок, моментально окисляющийся в кислороде воздуха, склянку с ним хранили в эксикаторе в атмосфере азота. Все операции при приготовлении раствора хлорида ванадия (III) проводили за максимально короткое время в вытяжном шкафу. Для предотвращения гидролиза раствор хлорида ванадия (III) готовили на 1н соляной кислоте. В кислой среде в присутствии избытка хлоридных ионов образуются комплексы [VCℓ42О)2]ˉ и их производные [1].

Для построения калибровочной кривой использовали 1М водный раствор NaNO2. Перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения градуировочного графика. Так как по предварительно полученным данным линейность кривой сохраняется в диапазоне концентрации нитрит-иона от 5 до 100 мкМ, из 10-3 М раствора NaNO2 получали растворы с концентрациями 5; 10; 20; 30; 50; 60; 70; 80; 90; 100 мкМ. Готовили серию из 10 пробирок, содержащих по 0,7 мл растворов NaNO2 с соответствующими концентрациями. Далее добавляли по 0,7 мл свежее приготовленного раствора хлорида ванадия и по 0,7 мл реактива Грисса. Соблюдая указанные условия в методике, пробирки помещали на 30 минут в водяную баню при температуре 37˚С. Каждый раствор серии готовили в 5 повторах. Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре марки ПЭ 4000В в кюветах с расстоянием между светопропускающими гранями 0,5 см при длине волны 540 нм. По полученным оптическим плотностям и известным концентрациям строили калибровочный график.

По методу наименьших квадратов было рассчитано уравнение калибровочного графика [2].

Оно имеет вид: yi = 0,021 + 0,00228х

Для решения вопроса о возможности применения методики спектрофотометрического определения уровня NO-метаболитов в разных биологических объектах использовали плазму крови и ткань головного и спинного мозга самцов белых крыс. Беспородные белые лабораторные крысы-самцы (40 животных) содержались в стандартных условиях вивария. Содержание крыс в виварии и проведение экспериментов соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», разработанным и утвержденным МЗ СССР (1977 г.), а также принципам Хельсинкской декларации (2000 г.). Декапитацию животных производили после наркотизации этаминалом натрия (внутрибрюшинно в дозе 5 мг на 100 г массы тела). После декапитации собирали кровь в пробирки, обработанные гепарином, центрифугировали и отбирали плазму для анализов. Весь биологический материал (головной и спинной мозг) подвергали быстрой заморозке при -20 С° в морозильной камере промышленного образца. Гомогенаты мозга готовили на фосфатном буферном растворе (рН 7,45) на холоде в кратчайшие сроки непосредственно перед исследованиями.

Определение нитрит ионов проводили после депротеинизации: к 1 мл плазмы крови добавляли двукратный избыток 96˚ этилового спирта, образовавшийся осадок денатурата отделяли центрифугированием при 3000 оборотов в минуту в течение 20 минут. Все последующие операции проводили аналогично, как и при получении растворов для градуировочного графика, соблюдая те же объемы реагентов, последовательность операций, временной и температурный режимы. Оптическую плотность раствора определяли при 540 нм. Количество нитрит-иона рассчитывали в мкмолях по калибровочной кривой. Таким способом определяли содержание суммарных метаболитов NO. Для измерения концентрации нитрита депротеинизированную плазму крови инкубировали с реактивом Грисса без добавления VCℓ3, а концентрацию нитратов рассчитывали, вычитая из уровня суммарных метаболитов концентрацию нитритов.

Приведенная методика была откорректирована для проведения анализа ткани мозга на содержание метаболитов монооксида азота. Гомогенаты центрифугировали с целью отделения твердых включений, затем проводили депротеинизацию добавлением двукратного избытка по объему 96˚ этанола. Образовавшийся осадок денатурата отделяли центрифугированием при 3000 оборотов в минуту, однако в отличие от плазмы крови эту операцию проводили не менее 45 минут. В некоторых случаях требовалось повторное центрифугирование, т. к. осадок при депротеинизации ткани мозга получался менее плотный и менее тяжелый, чем при анализе плазмы крови. Все остальные операции аналогичны описанным выше.

Результаты.

По указанной выше методике определяли содержание суммарных метаболитов NO в плазме крови и разных отделах ЦНС: большие полушария, промежуточный, средний мозг, мозжечок, продолговатый и спинной мозг. Эксперименты проводили на самцах и самках двух возрастных групп (6 и 24 месяца). Полученные результаты представлены в табл. и свидетельствуют о более высоком уровне NO-метаболитов в исследованных объектах самок, по сравнению с самцами одной возрастной группы.

Таблица. Уровень метаболитов монооксида азота в плазме крови и ткани мозга

 

Концентрация суммарных метаболитов NO, мкМ, (М±m)

Молодые (6 месяцев)

Старые (24 месяца)

самцы

самки

самцы

самки

Плазма крови

30,28±1,83

78,35±5,103#

67,24±3,362

54,14±1,998#

Большие полушария

19,1±0,573

38,4±1,536 #

20,51±1,026

40,15±1,606#

Промежуточный мозг

15,7±0,65

33,10±1,19 #

28,14±1,182

27,73±0,971

Средний мозг

18,5±0,777

51,2±1,792 #

22,17±1,058

48,49±1,455#

Мозжечок

28,6±1,144

46,8±1,217 #

31,58±1,579

40,11±1,203#

Продолговатый мозг

27,11±1,084

62,38±2,807#

38,71±1,936

51,17±2,047#

Спинной мозг

28,4±1,42

29,5±1,003

30,58±1,233

32,79±1,180

# - достоверно по сравнению с самцами того же возраста; ∆ - достоверно по сравнению с группой молодых животных.

Наиболее ярко половые различия выражены у молодых животных. С возрастом в результате разнонаправленного изменения уровня NO-метаболитов у крыс разного пола различия между самцами и самками уменьшаются. В спинном мозге у животных всех групп уровень монооксида азота примерно одинаков. Вероятно, это связано с тем, что спинной мозг является наиболее филогенетически древним отделом ЦНС.

Полученные результаты лежат в биологически допустимом диапазоне и согласуются с данными других авторов [4, 5], что позволяет применять описанную методику для определения уровня NO в различных биологических объектах.

Выводы. На основании полученных результатов показано, что модифицированная методика спектрофотометрического определения уровня NO-метаболитов позволяет получить воспроизводимые результаты не только в сыворотке [4], но и в плазме крови, а также в гомогенатах из ткани мозга. При условии достаточного количества биологического материала измерение оптической плотности полученных растворов возможно на спектрофотометрах марки ПЭ 4000В или его аналогов. Полученные результаты свидетельствуют о половых и возрастных особенностях уровня NO-метаболитов в плазме крови и ткани мозга.

Рецензенты:

  • Тризно Н.Н., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической физиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Астрахань.
  • Фельдман Б.В., д.б.н., зав. кафедрой биологии с курсом ботаники Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Астрахань.

Работа получена 27.07.2011.


Библиографическая ссылка

Мажитова М.В. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ МЕТАБОЛИТОВ МОНООКСИДА АЗОТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ И ТКАНИ МОЗГА БЕЛЫХ КРЫС // Современные проблемы науки и образования. – 2011. – № 3.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=4655 (дата обращения: 07.08.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074