Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ РАЗЛИЧНОЙ ТЯЖЕСТИ

Муратова Т.А. 1 Аль-Кубайси Ш.С. 1 Ларькова Е.С. 1 Сайгина О.А. 1 Леонтьев А.А. 1 Калабкин Е.А. 1 Летин А.В. 1 Морозов В.В. 1
1 ФГБОУ ВО «Национальный Исследовательский Мордовский Государственный университет им. Н.П. Огарёва»
Активация гранулоцитарных нейтрофилов, развивающаяся при остром панкреатите, сопровождается состоянием респираторного взрыва, приводящего к метаболическим и функциональным изменениям этих клеток и продукции провоспалительных медиаторов для реализации и совершения кооперативных реакций иммунной системы. Проведено клинико-лабораторное исследование 51 пациента с острым панкреатитом, которые были разделены на 2 группы: первая (n=28) – пациенты с острым панкреатитом легкой формы, и вторая (n=23) – больные острым панкреатитом тяжелой степени. Также обследованы здоровые индивидуумы (n=18) обоих полов, в возрасте от 25 до 55 лет. Оценка фагоцитарной активности сегментоядерных нейтрофилов проведена с помощью анализа восстановления нитросинего тетразолия (НСТ), содержания лизосомально-катионных белков и показателей среднего цитохимического коэффициента НСТ-спонтанного теста. Установлено, что на ранних сроках острый панкреатит характеризовался значимым активированием нейтрофильных гранулоцитов, которое модифицировалось в сопряженности с формой тяжести заболевания. При легкой тяжести болезни фагоцитарная активность наблюдалась лишь в первые 4 суток, а к конечным суткам приближалась вплотную к нормальным значениям. Однако в группе с острым панкреатитом тяжелой степени нейтрофильный взрыв сохранился в течение всего исследовательского периода.
панкреатит
нитросиний тетразолий
лизосомально-катионные белки
иммунитет
фагоцитоз
1. Барсук А.В., Нарсия В.В., Славинский А.А. Активация нейтрофильных лейкоцитов периферической крови у больных острым панкреатитом // Современные наукоемкие технологии. 2012. № 8. С. 8–9.
2. Галкин А.А., Демидова В.С. Нейтрофилы и синдром системного воспалительного ответа // Журнал имени профессора Б.М. Костюченка. 2015. Т. 2. С. 25–31.
3. Егоров В.И. Кучерявый Ю.А. Заболевания поджелудочной железы: книга для пациентов. М., 2014. 46 с.
4. Zhi-wen Yang, Xiao-xiao Meng, Ping Xu. Central role of neutrophil in the pathogenesis of severe acute pancreatitis. J. Cell. Mol. Med. 2015. № 19 (11). Р. 2513–2520.
5. Савченко А.А., Борисов А.Г., Здзитовецкий Д.Э., Кудряцев И.В., Медведов А.Ю., Мошев А.В., Гвоздев И.И. Фенотипический состав и функциональная активность моноцитов у больных острым панкреатитом // Медицинская иммунология. 2017. Т. 19. № 1. С. 45–54.
6. Hahn J., Knopf J., Maueröder C., Kienhöfer D., Leppkes M., Herrmann M. Neutrophils and neutrophil extracellular traps orchestrate initiation and resolution of inflammation. Clin. Exp. Rheumatol. 2016. V. 34. Р. 6-8.
7. Saluja A., Dudeja V., Dawra R., Sah RP. Early Intra-Acinar Events in Pathogenesis of Pancreatitis. Gastroenterology. 2019. V.156 (7). Р. 1979–1993.
8. Винник Ю.С., Дунаевская С.С., Антюфриева Д.А. Диагностическая роль интегральных гематологических показателей и хемилюминесценции нейтрофилов при тяжелом остром панкреатите // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2016. № 10. 86–90.

В настоящее время острый панкреатит (ОП) остается одним из проблемных вопросов среди абдоминальных патологий неотложной хирургии. Это обусловлено: деструктивным характером патологии у четверти пациентов с острым панкреатитом; высокой летальностью, которая составляет от 15 до 40% при легкой тяжести (стерильный панкреонекроз) и до 75% при тяжелой форме (инфицированный панкреонекроз); несвоевременной оценкой степени тяжести, диагностикой и поздним оказанием патогенетического лечения [1].

Согласно концепции ферментативной теории, развитие острого панкреатита начинается с активации энзимов поджелудочной железы по иным или другим причинам, с последующим повреждением своих тканей и их поступлением в кровообращение [2].

Формирование эндогенной ферментативной интоксикации запускает активацию системного воспалительного ответа, что приводит к прогрессированию заболевания и развитию грозных осложнений [3].

Для поддержания гомеостатического состояния внутренней среды требуется иммунный ответ, который заключается в возбуждении защитных реакций организма, усилении механизмов распознавания токсико-действующих веществ, обезвреживании, поглощении и удалении антигенных детерминант [4].

Изменения в системе иммунитета, находясь в обратной зависимости от глубины и распространении патоморфологических изменений в панкреасе, совместно обременяют друг друга и срывают механизм межсистемной регуляции [5]. Полиморфонуклеары, являющиеся классическими фагоцитами, обладают подвижностью, адгезивностью, высвобождением биологически активных веществ и сильного антибактериального агента (миелопероксидаза), способностью к хемотаксису и фагоцитозу и др. [6].

В клинической практике используются оценочные иммунный статус-тесты, основанные на химических свойствах азогидразонов (анализ восстановления нитросинего тетразолия (НТС)) – соединения (R1N=N-CR2=N-NHR3) – в образовании тетразолиевых свободных радикалов, и содержаниях лизосомально-катионных белков (ЛКБ) [7].

Отмечено, что результат НСТ-теста позволяет оценить функциональные резервы фагоцитов в результате активации метаболической, пероксидазных и кислородозависимых систем биоцидности. С другой стороны, ЛКБ-тест определяет неэнзимные катионные протеины, признанные самыми агрессивными и многофункциональными по механизму бактерицидного эффекта, и отражает кислородонезависимые реакции биоцидности [8].

Цель исследования: изучить функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов в условиях острого панкреатита различной тяжести.

Материалы и методы исследования

В основу работы входили результаты клинико-лабораторных и инструментальных исследований 51 пациента с острым панкреатитом, рандомизированных по полу, возрасту, давности патологии, этиологии возникновения, степени тяжести, клиническо-лабораторно-инструментальным данным, биохимическим анализам активности нейтрофильных лейкоцитов и разделенных на две группы:

первая (n=28) – в состав которой включены больные ОП легкой тяжести, и вторая группа (n=23) – с тяжелой степенью.

В то же время ряд показателей изучен у здоровых добровольцев (n=18) в возрасте от 24 до 57 лет обоего пола для сравнения с нормой.

Данная работа проведена на кафедре факультетской хирургии Медицинского института МГУ им. Н.П. Огарева, базирующейся в РКБ им. С.В. Каткова, г. Саранск.

Тяжесть пациентов оценена с помощью шкалы APACHE-II при их госпитализации в клинику. При этом отмечено, что сумма полученных баллов у больных I группы составила 3,5±0,24 балла, а у II – 11,5±0,61 баллов. Известно, что при количестве баллов шкалы более 9 определяется тяжелая форма.

Причиной развития острого панкреатита у пациентов являлось злоупотребление алкоголем и алиментарными факторами (68,6%) и желчнокаменной болезнью (31,4%).

Среди больных мужского возраста был 31 человек, женского – 20. При этом возрастная медиана составила 44 года, а интерквартильный размах 25-75% – 31-57 лет (мужчины – 41 год, ИКР – 26-57 лет, женщины – 48 лет, ИКР – 30-59 лет).

Пациентам данной работы при поступлении в хирургический стационар проведена базисная терапия, в схему которой включены: цитостатический (5-фторурацил по 10–15 мг/кг или циклофосфан по 1–1,5 мг/к), инфузионный (глюкозо-инсулиновые растворы по 800,0 мл 5% глюкозный раствор с инсулином 1 ед. на 4 г сухого вещества глюкозы, раствор Рингера или другой солевой раствор по 800,0 мл), спазмолитический (платифиллин 0,2% – 1,0, папаверин 2% - 2,0 мл, баралгин 2,0–3,0 мл, но-шпа 2% – 2,0 мл по 2–3 раза в сутки), антигистаминный (димедрол 1% - 1,0 мл), антибактериальный (цефазолин 2,0 г на 200 мл раствора хлорида натрия) компоненты.

Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) является окислительно-восстановительным индикатором. Нитросиний тетразолий, поступая в нейтрофилы, подвергается рекреации и преобразуется в нерастворимый формазан при участии кофермента никотинамидадениндинуклеотида. 0,05 мл венозной крови вносили на лунки планшета, затем добавляли раствор НСТ по 0,05 мл 0,2%. Далее смесь инкубировали в термостате при t +37,5 °C на 30 мин. Затем мазок средней толщины делали и фиксировали в растворе метанола на 5 мин. После того докрашивали раствором сафранина (0,5%) по 3–5 мин. Под микроскопом подсчитали 100 сегментоядерных нейтрофилов и определяли процент положительно реагирующих с НСТ клеток.

Содержание лизосомально-катионных белков (ЛКБ) определено с помощью красителей анионного типа (бромфенолового синего). Высушенный мазок венозной крови был фиксирован в течение 60–90 с в 5% сульфосалициловой кислоте и тщательно промыт дистиллированной водой. Этот мазок окрашивали в растворе бромфенолового синего (0,1%) в течение 1–2 мин., затем промывали в боратном буфере по 4–6 мин. и высушивали. Гранулы катионных протеинов окрашивались в синий цвет. Далее вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК) с помощью полуколичественного метода и по формуле Астальди-Верга.

Полученные цифровые результаты были обработаны с помощью метода вариационной статистики при использовании критерия t Стьюдента для определения статистической значимости средних величин как в случаях сравнения независимых выборок, так и при соотношении связанных групп. Для этого использовали Microsoft Word 2016, Microsoft Excel 2016 и программу Statistic 12.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Острый панкреатит разного характера течения сопровождался повышенной активацией иммунного ответа с первых суток, причем прослеживалась различная динамика перераспределения пулов нейтрофильных гранулоцитов в сопряженности с тяжестью патологии и периодом принимаемого лечения согласно анализу лизисомально-катионных белков и показателям теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-теста) (рис. 1, 2 и таблица).

Динамика цитохимической активности нейтрофильных гранулоцитов при остром легком панкреатите (М±m)

Показатель

Норма

Группы исследования

Этапы наблюдения, сут.

1

2

3

4

5

НСТ-тест-индуцированный, %

42,47

±2,67

I (n=28)

51,47

±3,99

55,49

±4,25

59,17

±3,71

61,04

±2,97

48,13

±3,46

II (n=23)

61,33

±4,65*

69,52

±5,65*

73,76

±5,22*

81,11

±5,04*

74,24

±5,11*

СЦК НСТ-теста, у.е.

0,66

±0,04

I (n=28)

1,09

±0,11

1,16

±0,04

1,23

±0,08

1,05

±0,08

0,75

±0,02

II (n=23)

1,48

±0,09*

1,62

±0,10*

1,58

±0,08*

1,75

±0,06*

1,43

±0,04*

ЛКБ-тест СЦК, у.е.

1,53

±0,03

I (n=28)

1,94

±0,04

1,81

±0,03

1,76

±0,02

1,69

±0,03

1,62

±0,02

II (n=23)

2,19

±0,06*

2,36

±0,08*

2,47

±0,06*

2,31

±0,03*

1,89

±0,06*

Примечания. Жирный шрифт – достоверность данных по отношению к данным нормы при р<0,05. * – достоверность данных по отношению к данным первой группы при р<0,05.

Согласно результатам спонтанного НСТ-теста установлено, что у пациентов с острым легким панкреатитом в ранние сроки поступления в клинику и через 2, 3 и 4 суток отмечался прирост содержания лейкоцитов на 17,2, 20,6, 25,4 и 35,7% (p<0,05) соответственно. В последующие сроки содержание лейкоцитов в крови соответствовало нормальным значениям (рис. 1).

Рис. 1. Динамика спонтанного НСТ-теста при остром панкреатите

Примечания здесь и далее: * – достоверность данных по отношению к данным нормы при р<0,05;

– – достоверность данных по отношению к данным первой группы при р<0,05

Большой клинический интерес по данному же тесту вызвали результаты во второй группе пациентов, у которых был острый панкреатит тяжелой формы, где отмечалось высокое содержание сегментоядерных нейтрофилов на протяжении всего периода наблюдения по отношению к норме на 36,3–78,3% (p<0,05) и первой группе (пациенты с легкой степенью острого панкреатита) на 30,7–49,3% (p<0,05) (рис. 1).

При изучении фагоцитарной активности сегментоядерных гранулоцитов (НГ) по индуцированному НСТ-тесту при остром панкреатите как легкой тяжести, так и тяжелой нами выявлено, что эта функциональная способность была повышена: в первой группе такая реакция фиксировалась на 1-2-3-4-м этапах исследовательского периода на 21,1–39,3% (p<0,05), а к 5-м суткам стандартной терапии приближалось к нормальному ответу (таблица).

Между тем в группе с тяжелым характером заболевания иммунный процесс был активный в течение всех суток на 44,4–90,9% (p<0,05). По данным этого исследования обращаем внимание на то, что реакция иммунной защиты ассоциировалась с тяжестью патологии, так как значение НГ во 2-й группе по данному тесту превышало первую во все время наблюдения на 25,2–54,1% (p<0,005) (таблица).

Систематическое исследование цитохимических особенностей согласно показателям среднего цитохимического коэффициента (СЦК) спонтанного НСТ-теста позволило установить, что у больных острым панкреатитом первой группы он был существенно (на 72,8%) повышен при поступлении и во 2-4-й день проведения стандартного лечения – на 47,4–16,9% (p<0,05) (рис. 2).

Рис. 2. Динамика СЦК НСТс-теста при остром панкреатите

Прогрессирование течения заболевания несло свое влияние на процесс иммунного ответа в виде усиления интенсивности, поскольку цитохимическая реакция во II группе на всех сутках исследовательского периода преувеличивала нормальный уровень на 169,4–115,2% (p<0,05), а в I группе на 55,8–108,1% (p<0,05) (рис. 2).

Согласно цитохимической реакции индуцированного НСТ-теста установлено, что острый панкреатит сопровождался токсогенной зернистостью нейтрофилов, которая было сопряжена со степенью тяжести, что определяет развитие «метаболического взрыва», активацию пероксидазных систем и отражает кислородозависимые процессы биоцидности. В первой группе результат данного теста превышал нормальный уровень в первые 4 суток на 75,4–59,0% (p<0,05). При этом к последнему этапу исследования активность НГ приближалась вплотную к норме (таблица).

Во второй группе цитохимическая запись была существенно высока на всех сроках наблюдения не только к нормальному уровню – на 124,2–165,1% (p<0,05). Всё-таки значительная активация фагоцитарного процесса в данной группе подтвердилась и при сравнении с результатом первой группой, в которой содержание НСТи-теста было ниже на – 39,6–90,5% (p<0,05) (таблица).

При изучении полученных данных ЛКБ-теста отмечено, что у пациентов с легким острым панкреатитом при госпитализации содержание ЛКБ возрастало на 26,7% (p<0,001) по отношению к исходному показателю. Повышенное (на 18,3%) количество их сохранялось и в последующие сутки. Через 3 и 4 суток содержание ЛКБ падало и по сравнению с нормой понижалось на 15,0 и 10,4% (p<0,05) соответственно. В срок 5 суток их уровень приближался к норме (таблица).

При остром панкреатите тяжелой степени выявлено повышение ЛКБ-показателя на первом этапе исследования на 43,1% (p<0,05). Значения данного теста продолжались увеличиваться в последующие сутки (2, 3 и 4-е) на 54,2–61,4% (p<0,05). К концу исследовательского периода результат этого анализа снижался по отношению к норме, но оставался выше на 23,5% (p<0,05).

Выводы

Острый панкреатит уже в первые сроки после поступления пациентов в стационар сопровождается значительной активностью сегментоядерных лейкоцитов, сопряженной со степенью тяжести патологии.

При легкой форме заболевания повышение цитохимической активности нейтрофильных гранулоцитов, в основном за счет кислородозависимых процессов, наблюдается лишь на протяжении первых суток (4) периода исследования. Причем резервные возможности НГ, оцениваемые по СЦК НСТи-теста, снижаются начиная с 3-го дня болезни, а к концу нормализуются.

Наиболее резкие и значимые модификации нейтрофильных гранулоцитов наблюдаются у пациентов с острым тяжелым панкреатитом как в начальный период (1-3-е сутки), так и в конечный (4-5-е сутки). Значительный прирост показателей НСТ-теста, СЦК НСТи-теста и содержания ЛКБ в течение всего наблюдаемого срока заболевания свидетельствует о высокой активации гранулоцитарных нейтрофилов и их функциональном и метаболическом ответе респираторным взрывом на развитие острого воспаления в поджелудочной железе.


Библиографическая ссылка

Муратова Т.А., Аль-Кубайси Ш.С., Ларькова Е.С., Сайгина О.А., Леонтьев А.А., Калабкин Е.А., Летин А.В., Морозов В.В. АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ РАЗЛИЧНОЙ ТЯЖЕСТИ // Современные проблемы науки и образования. – 2019. – № 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=29418 (дата обращения: 29.09.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074