Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ L-ГЛУТАМИЛ - L-ТРИПТОФАНА

Петленко И.С. 1 Егорова Т.Ю. 1 Петленко С.В. 2 Безгодков Ю.А. 1 Воронцова Т.Н. 3
1 ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» МЗ РФ
2 ФГБУН «Институт токсикологии» ФМБА России
3 ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена» МЗ РФ
Количество пациентов с незаживающими ранами возрастает год от года. Наряду с наличием различных заболеваний причиной их формирования у данных больных считают нарушения местной и общей иммунологической реактивности, приводящие к развитию хронического воспаления. Однако действие и механизмы биологической активности препаратов иммунокорректоров, в том числе «Тимоген», изучены недостаточно. В процессе работы проводили экспериментальное исследование влияния препарата «Тимоген» (L - глутамил – L - триптофана мононатриевая соль) в сравнении с препаратом «Актовегин» на процесс заживления экспериментальной неэпителизирующейся раны, активность матриксных металлопротеаз ММП-1, ММП-2, ММП-8 и ММП-9 в раневом отделяемом, образование грануляционной ткани в динамике раневого процесса. Показано, что влияние исследуемых препаратов является разнонаправленным. «Тимоген» ускоряет закрытие кожной раны, ингибирует активность матриксных металлопротеаз в раневом отделяемом экспериментальных животных (кроликов), что препятствует чрезмерному разрушению тканей раны при резорбции поврежденной ткани посредством данных ферментов, но замедляет процесс созревания грануляционной ткани. Перспективным следует считать применение препарата «Тимоген» в комплексном лечении ран, особенно диабетических язв преимущественно на начальном этапе заживления.
рана
воспаление
иммунотерапия
матриксные металлопротеазы
1. Богопольская А.С., Воронцова Т.Н., Вебер Е.В., Безгодков Ю.А. Современное состояние проблемы лечения пострадавших с переломами в области проксимального отдела бедренной кости // Современные проблемы науки и образования. 2017. № 2. [Электронный ресурс]. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26177 (дата обращения: 23.05.2019).
2. Вебер Е.В., Воронцова Т.Н., Богопольская А.С., Безгодков Ю.А. Маршрутизация взрослых пациентов с патологией тазобедренного и коленного суставов // Современные проблемы науки и образования. 2017. № 2. [Электронный ресурс]. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26314 (дата обращения: 23.05.2019).
3. Федотов А.Л., Безгодков Ю.А., Воронцова Т.Н. Современное состояние вопроса оказания помощи пациентам с переломами и переломовывихами в голеностопном суставе // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2014. Т. 173. № 3. С. 107-110.
4. Удовиченко О.В., Грекова Н.М. Диабетическая стопа. М.: Практическая медицина, 2010. 272 с.
5. Schultz G.S., Barillo D.J., Mozingo D.W., Chin G.A. Wound bed preparation and a brief history of TIME. International Wound Journal. 2004. vol. 1. No 1. Р. 19-32.
6. Gurtner G.C., Werner S., Barrandon Y., Longaker M.T. Wound repair and regeneration. Nature. 2008. vol. 453. No 7193. Р. 314-321.
7. Смирнов В.С. ( Ред.) Клиническая фармакология тимогена. СПб.: ФАРМин-декс, 2012. 106 с.
8. Нузова О.Б. Клинические и морфофункциональные особенности репаративной регенерации трофических язв нижних конечностей при их комплексном лечении с местным использованием милиацила и физических методов: автореф. дис. ... докт. мед. наук. Оренбург, 2010. 45 с.
9. Соловьева Н.И., Рыжакова О.С. Методы определения активности матриксных металлопротеиназ (ММП) // Клиническая и лабораторная диагностика. 2010. Т. 2. № 17. С. 21.
10. Соловьева Н.И., Винокурова С.В., Рыжакова О.С., Гуреева Т.А., Цветкова И.В. Экспрессия желатиназ А и В и эндогенных регуляторов их активности в иммортализованных и трансформированных фибробластах // Биомедицинская химия. 2009. Т. 55. № 4. С. 441-450.
11. Зиновьев Е.В., Асадулаев М.С., Комиссаров И.А., Шемет М.В., Юдин В.Е., Шабунин А.С., Смирнова Н.В., Крюков А.Е., Лукьянов С.А., Стояновский Р.Г., Шалоня Т.А., Арцимович И.В., Костяков Д.В. Возможность применения низкотемпературной атмосферной плазмы и биополимерных раневых покрытий для лечения ожогов кожи III степени (экспериментальное исследование) // Педиатр. 2017. Т. 8. № 3. С. 23-31.
12. Зиновьев Е.В., Юдин В.Е., Асадулаев М.С., Цыган В.Н., Костяков Д.В., Шабунин А.С., Смирнова Н.В., Крюков А.Е., Панеях М.Б., Лукьянов С.А., Арцимович И.В., Лопатин И.М., Зубов В.В., Крылов П.К., Вагнер Д.О., Османов К.Ф., Багатурия Г.О. Опыт применения стволовых клеток при лечении ожогов кожи // Педиатр. 2018. Т. 9. № 4. С. 12-27.

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в медицине в последние десятилетия, проблема лечения длительно незаживающих ран, трофических нарушений кожи, пролежней далека от своего полного решения [1-3]. Количество пациентов с незаживающими ранами возрастает год от года. Это связывают с увеличением заболеваемости диабетом, формированием иммунологических и обменных нарушений, а также увеличением количества хирургических вмешательств [4; 5]. Наряду с наличием различных заболеваний причиной формирования незаживающих ран у этих больных считают нарушения местной и общей иммунологической реактивности, приводящие к развитию хронического воспаления, сопровождающегося усиленной секрецией провоспалительных цитокинов, изменением активности матриксных металлопротеаз (ММП), снижением продукции факторов роста, что в целом тормозит процессы регенерации и ранозаживления [6]. Данные литературы свидетельствуют о том, что L-глутамил- L-триптофан («Тимоген») оказывает модулирующее влияние на метаболические процессы, стимулирует функциональную активность клеток иммунной системы, обладает антиоксидантным действием, стимулирует процессы регенерации тканей, ускоряет заживление ран, активизирует функции клеток соединительной ткани, эндотелиоцитов, макрофагов и лейкоцитов в очаге повреждения, ингибирует продукцию гистамина и серотонина при воспалении [7]. В доклинических испытаниях показана способность «Тимогена» улучшать ранозаживление. Однако терапевтическое действие и механизмы биологической активности препарата «Тимоген» изучены недостаточно.

Цель исследования: изучить эффективность и клеточные механизмы синтетического аналога регуляторного пептида тимуса L-глутамил- L-триптофана препарата «Тимоген» (L-глутамил - L-триптофана мононатриевая соль) и препарата сравнения «Актовегин» на заживление неэпителизирующихся ран экспериментальных животных.

Задачи исследования: определить в динамике влияние препаратов «Тимоген» и «Актовегин» на 1) площадь эпителизации и время закрытия ран, 2) протеолитическую активность раневого экссудата путем определения активности ММП, 3) гистоморфологические процессы реэпителизации на момент полной эпителизации раны.

Материал и методы исследования

В асептических условиях паравертебрально у кролика формировали дефект кожи, подкожной клетчатки, поверхностной и собственной фасций круглой формы диаметром 22 мм, края кожи подшивали к краю силиконового кольца [8]. Рану укрывали стерильной повязкой. Раз в 3 суток под наркозом осуществляли перевязки, туалет раны, сбор раневого отделяемого для оценки активности ММП. После выведения животных из опыта рану иссекали для гистологического исследования.

Животным с 1-го по 21-й день после моделирования патологии внутрибрюшинно вводили 5,0 мл препарата «Тимоген» (группа 1, n=3), 5,0 мл препарата «Актовегин» (группа 2, n=3), 5,0 мл раствора хлорида натрия 0,9% (группа 3, n=3).

Площадь ран измеряли каждые 3 суток методом фотофиксации и рассчитывали индекс эпителизации раны в процентах от первоначальной площади раны.

Время закрытия ран определяли как интервал, необходимый для прекращения получения раневого отделяемого из-за полного высыхания поверхности раны. На каждом животном моделировали 4 раны, которые могли закрываться не одновременно, а результат рассчитывался как средняя величина.

Наличие, а также активность ММП (ММП-1, ММП-2, ММП-8 и ММП-9) в пробах раневого экссудата оценивали методом зимографии на желатине и на казеине на 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24-й день от начала эксперимента [9; 10].

Гистоморфометрическое исследование проводили для всех животных, из расчета 1 рана - 1 препарат. Материал из дна раны фиксировали в 10% растворе формалина для морфологического изучения. Готовили гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином. Осуществляли описательную микроскопию, оценивая изменение площади раны и состояние грануляционной ткани дна раны. Для количественной оценки выделяли несколько параметров: интенсивность нейтрофильной инфильтрации, наличие периваскулярного отека, гигантских эпителиоидных клеток и геморрагических очагов, характеризующих остроту воспалительной реакции, количество и состояние сосудов грануляционной ткани, отражающие скорость формирования грануляционной ткани и завершенность процесса эпителизации раны. Состояние грануляционной ткани оценивали полуколичественным способом (0 - отсутствие параметра, 1 – малое количество, 2 – среднее количество, 3 – большое количество). Размеры гистологических элементов оценивали микроскопом «ЛЮМАМ - И3» с увеличением 400х. Количество и размеры гистологических элементов на каждом микропрепарате подсчитывали в 10 полях зрения, выбранных случайно в пределах 2000 мкм от дна (просвета полости) раны, но выше неизмененных тканей.

Результаты представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения. Установлено что, согласно критерию Лиллиефорса, распределение показателей соответствует нормальному. Различия оценивались с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Площадь ран на 21-е сутки в группе 1 после применения «Тимогена» составила 18,3±1,9% от исходной, что было существенно, на 21,1%, меньше по сравнению с группой 2 после применения «Актовегина» (39,4±2,2%)   и на 13,3% относительно группы 3 (31,6±2,4%). «Тимоген» способствовал достоверному ускорению уменьшения площади раны, в то время как введение «Актовегина» приводило даже к некоторому замедлению сокращения площади раны.

Время закрытия экспериментальных ран в группе 1 после применения «Тимогена» (18 суток) было существенно, на 6 суток, меньше по сравнению с группой 2 (больше 24 суток) и группой 3 (больше 24 суток).

Сбор проб для определения активности ММП в раневом отделяемом проводили до момента высыхания раны, что и считали моментом ее закрытия. При расчете уровня активности исходным считали уровень ММП в крови данного животного, взятой в нулевые (0) сутки в начале эксперимента. Снижение активности ММП до 0 означает снижение активности до исходного уровня. Динамика активности желатиназ в контрольной группе 3 соответствовала стандартному течению заживления раны. Введение препарата «Актовегин» сопровождалось снижением активности ММП после 6 суток, сглаживая пик повышения активности, связанный с изменением клеточного фона раны, при этом закрытие раны не было завершено на 24-е сутки. Введение препарата «Тимоген» приводило к повышению активности ММП до 9 суток, после чего активность снижалась, и рана закрывалась быстрее (на 21-е сутки), чем при введении препарата сравнения и в контрольной группе (таблица 1).

Таблица 1

Суммарный уровень активности ММП (желатиназы) в группах

Сроки исследования (сутки)

Активность ММП (желатиназы) в раневом отделяемом (отн. ед.) в группах сравнения (вводимые препараты)

Группа 1 «Тимоген»

Группа 2 «Актовегин»

Грруппа 3 «Контроль»

0

3200±620

1200±190

2300±280

3

5500±760

4200±800

3800±640

6

5000±880

4000±670

4100±640

9

5700±910

3800±600

4200±630

12*

4000±650

3900±600

5500±680

15

3200±570

3700±550

2800±400

18

2300±370

2900±380

2000±380

21

0±0**

1000±130

1700±270

24

0±0***

1000±140

0±0

* - извлечение пластикового кольца. ** - достоверные отличия группы 1 относительно групп 2 и

3 (р≤0,05). *** - достоверные отличия групп 1 и 3 относительно группы 2 (р≤0,05).

Динамика активности коллагеназ в контрольной группе 3 соответствовала стандартному процессу заживления раны. Введение препарата «Актовегин» приводило к снижению активности ММП, сглаживая пики повышения активности до 12 суток, после чего активность ММП была выше, чем в контроле, что приводило к более раннему прекращению действия коллагеназ в экспериментальной ране на 21-е сутки. Введение «Тимогена» приводило к некоторому снижению общей активности ММП в течение всего раневого процесса и быстрому снижению активности ММП до начального уровня в более ранние сроки (на 18-е сутки), чем в остальных группах (таблица 2).

Раздельный учет динамики активности коллагеназ и желатиназ в процессе заживления экспериментальной раны по изоформам (ММП-2 и ММП-9 – желатиназы; ММП-8 и ММП-1 – коллагеназы) выявил следующие особенности, обусловленные введением различных препаратов (таблицы 3, 4).

Таблица 2

Суммарный уровень активности ММП (коллагеназы) в группах

Сроки исследования (сутки)

Активность ММП (коллагеназы) в раневом отделяемом (отн. ед.) в группах сравнения (вводимые препараты)

Группа 1 «Тимоген»

Группа 2 «Актовегин»

Группа 3 «Контроль»

0

600±110

2000±370

500±80

3

3200±610

2500±440

4500±810

6

4700±870

3700±680

5300±830

9

4500±830

3600±610

4500±740

12*

3000±590

3500±590

5000±890

15

3200±640

4200±710

2100±330

18

0±0**

3400±600

1800±240

21

0±0**

100±17

2000±290

24

0±0

0±0

0±0

* - извлечение пластикового кольца. ** - достоверные отличия группы 1

относительно групп 2 и 3 (р≤0,05).

В контрольной группе динамика активности ММП-2/ММП-9 соответствовала обычному профилю данных ферментов в процессе заживления раны - то есть отмечалось повышение ее активности на 9-12/3-9 сутки после моделирования раны с падением активности до нулевых значений. Введение животным препарата сравнения «Актовегин» снижало активность ММП-2/ММП-9, способствуя сглаживанию пиковой активности после 6/12 суток, а непосредственно после 15 суток наблюдения активность ММП-2/ММП-9 была практически идентична динамике уровня фермента в контрольной группе. Введение препарата «Тимоген» приводило к некоторому общему снижению активности ММП-2/ММП-9 и сглаживанию пиков активности, при этом уровень активности ММП-2/ММП-9 снижался до исходного уровня быстрее (на 21 сутки), чем в других группах (на 24-е сутки).

Таблица 3

Динамика активности изоформ желатиназ (ММП-2 и ММП-9) в группах

Сроки исследования

(сутки)

Активность ММП (желатиназы) в раневом отделяемом (отн. ед.)

Группа 1 «Тимоген»

Группа 2 «Актовегин»

Группа 3 «Контроль»

ММП-2

ММП-9

ММП-2

ММП-9

ММП-2

ММП-9

0

1900±220**

700±90

700±110

300±50

800±90

700±90

3

1700±220

2400±340

1300±200

2300±400

1000±150

3800±540

6

1500±180

2500±300

1700±230

2200±270

1600±210

3600±430

9

1800±160

3700±420

1300±160

2400±310

1700±180

3400±380

12*

1300±180

2000±300

1300±200

2600±240

2500±330

3000±270

15

1200±190

1900±260

1200±130

2000±190

1300±180

1800±250

18

800±90

1500±210

800±100

1700±190

1000±110

1300±130

21

0±0**

0±0**

500±70

1000±120

800±80

1000±110

24

0±0***

0±0***

500±70

1000±100

0±0

0±0

* - извлечение пластикового кольца. ** - достоверные отличия группы 1 относительно

групп 2 и 3 (р≤0,05); *** - достоверные отличия групп 1 и 3 относительно группы 2 (р≤0,05).

При отсутствии специфической терапии (контроль) динамика активности ММП-1/ММП-8 соответствовала классическим канонам заживления раны, то есть повышение ферментативной активности достигало максимума на 12/3 сутки после моделирования раны с постепенным литическим снижением до нулевых значений в дальнейшем ходе процесса. Системное введение препарата «Актовегин» приводило к резкому угнетению активности ММП-1/ММП-8 на 9/3 сутки, которое с небольшими колебаниями сохранялось вплоть до окончания процесса. Применение препарата «Тимоген» также приводило к достоверному по сравнению с контрольной группой снижению активности ММП-1/ММП-8 и последующему более быстрому прекращению действия этих изоформ коллагеназы (таблица 4).

Таблица 4

Динамика активности изоформ коллагеназ (ММП-1 и ММП-8) в группах

Сроки исследования

(сутки)

Активность ММП (коллагеназы) в раневом отделяемом (отн. ед.)

Группа 1 «Тимоген»

Группа 2 «Актовегин»

Группа 3 «Контроль»

ММП-1

ММП-8

ММП-1

ММП-8

ММП-1

ММП-8

0

300±40

200±40

400±50

700±40

250±30

250±30

3

1400±180**

1400±140**

1000±110

900±130

150±20

2600±430

6

2300±300**

1800±250**

1700±240

1400±190

1000±120

2300±310

9

1800±270

2000±330

1500±210

1800±270

2400±310

2100±300

12*

1000±100**

1200±220**

1600±270

1400±230

3000±440

2000±320

15

1200±210

1000±170

1600±290

1100±200

700±100

800±90

18

0±0**

0±0

1000±150

900±90

500±70

250±20

21

0±0**

0±0**

0±0

300±50

500±90

500±80

24

0±0

0±0

0±0

0±0

0±0

0±0

* - извлечение пластикового кольца. ** - достоверные отличия группы 1 относительно

групп 2 и 3 (р≤0,05).

Результаты гистологического исследования показали, что толщина лейкоцитарно-некротического слоя после введения препаратов «Тимоген» и «Актовегин» была меньше, чем в контрольной группе, что указывает на более слабую инфильтрацию воспалительных клеток. Периваскулярный отек был минимальным в контроле. Количество геморрагических очагов во всех группах статистически не отличалось. Количество расширенных полнокровных сосудов было достоверно минимальным для препарата «Тимоген» (р≤0,05) по сравнению с другими группами наблюдения.  Степень эозинофилии была минимальной для препарата «Актовегин».

Результаты подсчета гистологических элементов показали, что эпителизация лучше всего проходила в случае введения препаратов сравнения («Тимоген» и «Актовегин») по сравнению с контрольной группой. Грануляционная ткань была сформирована во всех трех группах. Однако состояние и количество сосудов грануляционной ткани при введении препаратов сравнения было ниже, чем в контрольной группе. При этом созревание грануляционной ткани прошло нормально в группах с использованием «Актовегина» и в контроле. При использовании «Тимогена» грануляционная ткань была незрелой, с разной степенью задержки развития.

Толщину и длину слоя молодого эпидермиса измеряли в мкм на гистологических образцах тканей раны. При этом слой эпидермиса при введении препаратов сравнения покрывал практически всю поверхность среза ткани раны, а в контрольной группе - только часть его.

Заключение

Результаты проведенного исследования позволяют утверждать, что влияние исследуемых препаратов является разнонаправленным.

Площадь раны сокращалась быстрее при введении препарата «Тимоген» и медленнее при введении препарата «Актовегин».

Эпителизация раны шла быстрее при введении обоих исследуемых препаратов, но состояние грануляционной ткани и ее созревание было замедленным.

Динамика активности ММП во всех случаях статистически отличалась от хода нормального заживления раны (контроля). Профили активности ММП при введении исследуемых препаратов были сглаженными, отсутствовали резкие подъемы активности, имеющиеся в контроле. При этом снижение уровня активности до исходного при введении препарата «Тимоген» происходило раньше, чем при введении физиологического раствора и препарата «Актовегин».

«Тимоген» ингибирует действие ММП, что препятствует чрезмерному разрушению тканей раны при резорбции поврежденной ткани посредством данных ферментов (ММП-8 и ММП-9). Но при таком ингибировании созревание грануляционной ткани происходит позже, так как ММП в этом процессе также принимают активное участие (ММП-2 и ММП-1). Именно этот феномен и наблюдался в поставленном эксперименте.

Для ускорения улучшения созревания грануляционной ткани и заживления раны, возможно, будет достаточно использование «Тимогена» только на начальном этапе заживления раны, до начала созревания новообразованной грануляционной ткани. При этом необходимо изучить концентрационные зависимости исследуемого препарата, способные только частично ингибировать ММП.

Повышенное содержание ММП характерно для диабетических язв. Именно в этом случае необходима нормализация состояния раны, для чего возможно применение препарата «Тимоген» в качестве ингибитора ММП.

На последующих этапах лечения возможно внесение дополнительных компонентов - белков внеклеточного матрикса или их фрагментов для создания матрикса, способного удерживать клетки, а также для лучшей адгезии клеток ткани пациента к раневому ложу и дальнейшей их пролиферации [11; 12]. Вносимые белки внеклеточного матрикса будут также основой для синтеза грануляционной ткани, не разрушаемой при пониженной активности ММП.


Библиографическая ссылка

Петленко И.С., Егорова Т.Ю., Петленко С.В., Безгодков Ю.А., Воронцова Т.Н. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ L-ГЛУТАМИЛ - L-ТРИПТОФАНА // Современные проблемы науки и образования. – 2019. – № 3.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=28988 (дата обращения: 05.06.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074