Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

АССОЦИАЦИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА 1-ГО ТИПА С ПОЛИМОРФНЫМИ АЛЛЕЛЯМИ ГЕНОВ HLA КЛАССА II В ПОПУЛЯЦИИ ЯКУТОВ

Павлова Н.И. 1 Куртанов Х.А. 1 Дьяконова А.Т. 1 Соловьева Н.А. 1 Сыдыкова Л.А. 2, 3 Александрова Т.Н. 1 Филиппова Н.П. 1 Никифорова М.Е. 4 Додохов В.В. 1, 5
1 ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем»
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова", Медицинский институт
3 ГБУ РС(Я) "Якутская республиканская клиническая больница"
4 ГАУ РС(Я) "РБ №1-НЦМ" Отделение детской эндокринологии
5 ФГБОУ ВО Якутская ГСХА
Впервые в якутской популяции проведен молекулярно-генетический анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 генов HLA-DQA1 и HLA-DQB1 соответственно. Протестированы 92 пациента с диагнозом СД 1-го типа, из которых 44 мужчины, 48 женщины. Средний возраст пациентов составил 23,04±0,27 года (от 4 до 56 лет). В качестве группы сравнения была сформирована выборка из здоровых добровольцев в количестве 210 человек. Амплификация области гена HLA-DQA1, содержащего однонуклеотидный полиморфизм rs3104413, осуществлялась в процессе ПЦР в реальном времени, области гена HLA-DQB1 содержащих полиморфизмы rs2854275 и rs9273363 – аллель специфичной ПЦР. Анализ распределения генотипов показал, что наиболее распространенным генотипом по полиморфизму rs3104413 в группе больных СД 1 является С/С (69,6%), тогда как в контрольной группе чаще встречался гомозиготный вариант G/G (41,1%). Выявлено, что самым распространенным генотипом полиморфного варианта rs2854275 в группе контроля является гомозиготный генотип G/G (88,5%), а в группе больных СД 1-го типа – генотип G/Т (56,3%). Полиморфный вариант rs9273363 характеризовался достоверно низкой частотой аллеля А (1,5%) в группе здоровых индивидов по сравнению с группой больных СД 1-го типа (53,6%). Наиболее высокие показатели относительного риска (RR) среди генотипов выявлены для сочетания генотипа С/С полиморфизма rs3104413 с гетерозиготным генотипом G/T полиморфизма rs2854275 – RR составил 4,234 (р<0,001); для сочетания генотипа С/С полиморфизма rs3104413 с генотипом Т/Т полиморфизма rs2854275 RR = 3,692 (р<0,001); для сочетания генотипа G/G полиморфизма rs3104413 с генотипом А/С полиморфизма rs9273363 RR = 3,625 (р<0,001). Полученные данные могут быть использованы в качестве биологических предикторов развития СД 1-го типа с целью проведения своевременных персонализированных профилактических мероприятий.
гены hla ii класса
сахарный диабет 1 типа
полиморфизм
якуты
1. Дедов И.И., Шестакова М.В., Викулова О.К. Эпидемиология сахарного диабета в Российской Федерации: клинико-статистический отчет по данным Федерального регистра сахарного диабета // Сахарный диабет. 2017. Т. 20. № 1. С. 13-41. DOI: 10.14341/DM8664.
2. Atkinson M.A. The pathogenesis and natural history of type 1 diabetes. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2012. Vol. 2. no. 11. P. a007641. Published., DOI:10.1101/cshperspect.a007641.
3. van Belle T.L., Coppieters K.T., von Herrath M.G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiological reviews. 2011. Vol. 91. no. 1. P. 79-118. DOI: 10.1152/physrev.00003.2010.
4. Rich S.S., Concannon P. Role of Type 1 Diabetes-Associated SNPs on Autoantibody Positivity in the Type 1 Diabetes Genetics Consortium: Overview. Diabetes care. 2015. Vol. 38. no. 2. P. S1-S3. DOI: 10.2337/dcs15-2001.
5. Сайт «1000 геномов» [Электронный ресурс]. URL: http://www.internationalgenome.org/ (дата обращения: 20.01.2019).

Сахарный диабет 1-го типа (СД 1) – метаболическое (обменное) заболевание, характеризующееся гипергликемией, в основе которого лежит деструкция β-клеток, приводящая к абсолютному дефициту инсулина.

Сахарный диабет представляет собой важнейшую медико-социальную проблему во всем мире. Это объясняется его широким распространением, тяжестью поздних осложнений, дороговизной средств диагностики и лечения, которые необходимы больным в течение всей жизни. По данным Росстата на сегодняшний день в мире насчитывается более 400 млн человек, больных СД, и распространенность заболевания продолжает неуклонно расти. На начало 2017 г. общая численность пациентов, страдающих СД, в РФ составила 4,348 млн человек, из них: 4 млн – СД 2-го типа, 255 тыс. – СД 1-го типа и 75 тыс. – СД других типов. По последним данным в Республике Саха (Якутия) с диагнозом СД проживают 21 677 человек, из них: 20 508 – это пациенты с СД 2-го типа, 1099 – больные СД 1-го типа, 70 человек страдают СД других типов [1].

Согласно современным данным в развитии СД 1-го типа принимают участие большое число генов [2], более половины генетических рисков обусловлено участием полиморфных вариантов генов HLA, расположенных на коротком плече хромосомы 6 (6p21). Полагая, что вклад генетических факторов в риск развития СД 1-го типа составляет более 50%, полный вклад полиморфных аллелей локуса HLA может быть оценен более чем 25%.

Определение аллелей HLA помогает в определении риска развития СД 1-го типа. Это особенно полезно в профилактике у пациентов с высокой степенью риска [3]. HLA-типирование также требуется в генетических исследованиях, направленных на определение молекулярной основы СД 1-го типа [4]. Тем не менее высокая стоимость HLA генотипирования является одной из основных проблем, препятствующих проведению масштабных исследований. В связи с этим ведутся исследования по определению HLA аллелей с использованием однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) (Walsh E.C. et al., 2003; Leslie S. et al., 2008; Dilthey A.T. et al., 2011; Ferreira R.C. et al., 2012; Barker J.M. etal. 2008; Cao Ngueyen et al., 2013).

В России исследования по определению HLA-аллелей с использованием однонуклеотидных полиморфизмов не проводятся. В связи с этим на сегодняшний день существует необходимость в проведении исследований, направленных на разработку регионально-адаптированного метода HLA-типирования СД 1-го типа с помощью однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).

Целью данного исследования являлось выявление ассоциации полиморфных вариантов генов HLA II класса с СД 1-го типа среди якутской популяции.

Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работ по генотипированию полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363 была проведена в лаборатории наследственной патологии отдела молекулярной генетики Якутского научного центра комплексных медицинских проблем (ЯНЦ КМП). Для исследования использованы образцы ДНК из коллекции биоматериала ЯНЦ КМП с применением УНУ «Геном Якутии» (рег. № USU_507512). Выборка состояла из 92 пациентов больницы ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем», ГАУ РС(Я) РБ № 1 НЦМ Педиатрический центр и эндокринологического отделения ГБУ РС (Я) «Якутская городская клиническая больница» г. Якутска. В состав выборки вошли 92 пациента с диагнозом СД 1-го типа в возрасте от 4 лет до 56 лет, проживающих в РС (Я), якутов по этнической принадлежности. По половому признаку пациенты разделились на 44 мужчин (47,8%) и 48 женщин (52,2%). Средний возраст пациентов составил 23,04±0,27 года (от 4 до 56 лет), средний возраст пациентов мужского пола – 20,5±2,3 года (от 5 до 40 лет), женского пола – 25,11±2,59 года (от 4 до 56 лет). Популяционную выборку составили 210 якутов, не страдающих СД 1-го типа. Этническая принадлежность учитывалась до третьего поколения.

Амплификация области гена HLA-DQA1, содержащего однонуклеотидный полиморфизм rs3104413, осуществлялась в процессе ПЦР в реальном времени с использованием пар праймеров и аллельспецифичных зондов для амплификации ДНК, описанных в журнале «NATURE COMMUNICATIONS» (Isabelle Serr et al., 2015). Праймеры и зонды синтезированы компанией ООО «Биотех-Индустрия (Lumiprobe)» (Москва, Россия). Последовательность праймеров: Форвард праймер 5'-CAGCTGAGCACTGAGTAG-3', реверс праймер 5'-GCAGTTGAGAAGTGAGAG-3'. Структура зондов: FAM – Probe rs3104413 LPC [6FAM]CAGCCT[+G]CT[+C]TC[+C]TA[+T]TGG[BHQ1], HEX – Probe rs3104413 LPG [HEX]CAGCCT[+G]CT[+G]TC[+C]TA[+T]TGG[BHQ1].

Амплификация проводилась согласно температурной программе, приведенной ниже (табл. 1).

Таблица 1

Температурная программа амплификации полиморфизма rs3104413

Стадии

Температура

Время

Циклы

1

Первая денатурация

95°С

0:10

1 цикл

2

Денатурация

95°С

0:30

50 циклов

3

Отжиг

55°С

1:00

 

Измерение сигнала флуоресценции проводилось на втором этапе реакции (55°С – 1:00). Детекция флуоресценции осуществлялась «по конечной точке» согласно протоколу прибора «Real-time CFX 96 Touch» («Biorad», США). Пример распределения облаков генотипов проведения ПЦР и детекции флуоресценции «по конечной точке» представлен на рисунке 1. Соответствие флуоресцентных красителей: аллель C – канал FAM, аллель G – канал HEX.

Рис. 1. Распределение облаков генотипов полиморфизма rs3104413 гена HLA-DQA1. Примечание: «К–» – отрицательный контроль, C/C – гомозигота по предковому аллелю C. C/G – гетерозигота, G/G – гомозигота по мутантному аллелю G

Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) rs2854275, rs9273363 проводился с помощью аллельспецифичных праймеров (АС-ПЦР). Праймеры были синтезированы компанией ООО «Сибэнзим» (г. Новосибирск, Россия). В рамках настоящей работы были созданы оригинальные аллельспецифичные праймеры на основе референсного генома hg38/Human по базе UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html). Последовательность праймеров и условия ПЦР представлены в таблице 2.

Таблица 2

Последовательность праймеров и условия АС-ПЦР*

Ген/

Антиген

Метод генотипирования

Структура праймеров

tоС

отжига праймеров

,

Мутант- ный аллель

rs2854275

АС-ПЦР*

Внутренний форвард праймер:

5’-CTTAACTTTGGTGGCATCTTCTTGTG-3’

Внутренний реверс праймер:

5’- AAGCTGTGGTTCTGGCTCCACATTTA-3’

Наружный форвард праймер:

5’-TAAGAGGGAAGAGCATGAGCTGAGT-3’

Наружный реверс праймер:

5’-TCTTTCAGTCACTGGAAAATGCTTACA-3’

64

134, 192 п.о.**

rs9273363

АС-ПЦР*

Внутренний форвард праймер:

5’-TGCTTTCAGGGTCATGGCCTTC-3’

Внутренний реверс праймер:

5’-TGGGAGCTTCTGCGAGGTTATGT -3’

Наружный форвард праймер:

5’-TAGTTCTCCACTCTGACCTCATC-3’

Наружный реверс праймер:

5’-GTTATGAGGGAGGTCACTACACA -3’

67

146, 141 п.о.**

β-globin***

АС-ПЦР* (Вутрен-ний контроль)

F: 5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’

R: 5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’

57

268 п.о.**

 

Примечание. * – АС-ПЦР – аллель-специфическая ПЦР, ** – п.о. – пара оснований. *** – Dominquez O et al., 1992; Michelle A.M. et al., 2000; Steffens Nakken et al., 1995

Результаты амплификации и рестрикции фракционировали в 3–4%-ном агарозном геле с бромистым этидием при напряжении 120–300 Вт в течение 30–45 мин. Анализ результатов электрофореза проводили под UV-лучами в гель-документирующем приборе Vilbеr Lourmat (рис. 2, 3).

Рис. 2. Электрофореграмма продукта амплификации rs2854275 в 2%-ном агарозном геле Примечание: п.н. – пар нуклеотидов. М – ДНК маркер pUC19/MspI. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 – нумерация образцов. 270 п.н. – внутренний контроль. 192 п.н. – аллель T, 134 п.н. – аллель G

Рис. 3. Электрофореграмма продукта амплификации rs9273363 в 2%-ном агарозном геле Примечание: п.н. – пар нуклеотидов. М – ДНК маркер pUC19/MspI. 1, 2, 3, 4, 5 – нумерация образцов. 270 п.н. – внутренний контроль. 141 п.н. – аллель A, 146 п.н. – аллель C

Статистический анализ полученных результатов медико-генетического исследования был проведен с помощью программы: «Office Microsoft Excel 2010», «Statistica 8.0». Частоты аллелей и генотипов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 определяли путем прямого подсчета. Результаты считались значимыми, когда значение «р» было меньше 0,05 (p<0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенного анализа установлено, что только для полиморфного варианта rs2854275 в популяции якутов наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии Харди–Вайнберга (РХВ). Отклонение установлено для полиморфного варианта rs3104413 (Х²=65,966, р<0,001), которое характеризовалось уменьшением уровня наблюдаемой гетерозиготности (Но=0,219) по сравнению с ее ожидаемым уровнем (Не=0,498). Для полиморфного варианта rs9273363 (Х² = 134, р<0,001), которое характеризовалось уменьшением уровня наблюдаемой гетерозиготности (Но=0,0) по сравнению с ее ожидаемым уровнем (Не=0,029) (табл. 3).

Таблица 3

Распределение генотипов и аллелей полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363 в популяционной выборке якутов

Полимор-физм

Кол-во человек, n

Генотип, %

Распределение

аллелей

Но

Не

Х2

р

rs3104413

210

С/С

C/G

G/G

С

G

0,219

0,498

65,966

<0,001

36,2

21,9

41,9

0,471

0,529

rs2854275

122

Т/Т

Т/G

G/G

Т

G

0,157

0,145

1,297

0,255

0,0

15,7

84,3

0,079

0,921

rs9273363

134

А/А

А/С

С/С

А

С

0,0

0,029

134

<0,001

1,5

0,0

98,5

0,015

0,985

Примечание: n – численность выборки, Ho, He – наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность, Х2 по Харди–Вайнбергу, р – уровень достоверности

Согласно базе данных проекта «1000 геномов» для полиморфизма rs3104413 во всех исследованных выборках популяций мира установлены высокая частота мутантного аллеля С (78–92%) и низкая частота предкового аллеля G (8–22%) [5]. В исследованной выборке якутов частота предкового аллеля G была выше и составила 52,9%, тогда как частота мутантного аллеля С характеризовалась более низкими значениями и составила 47,1%, что может быть следствием как недостаточного объема выборки, так и этнической особенности.

Для полиморфизма rs2854275 в исследованной выборке якутов частота предкового аллеля G (92,1%) преобладала над частотой мутантного аллеля Т (7,9%), что сопоставимо с результатами ранее проведенных исследований, в которых отмечаются высокая частота предкового аллеля G (90–97%) и низкая частота мутантного аллеля Т (3–10%) [5].

Полиморфизм rs9273363 у якутов характеризовался преобладанием частоты предкового аллеля С (98,5%) по сравнению с частотой мутантного аллеля А (1,5%), что согласуется с результатами ранее проведенных исследований, в которых отмечаются высокая частота предкового аллеля С (67–91%) и низкая частота мутантного аллеля А (9–33%) [5].

Результаты анализа распределения частот аллелей и генотипов полиморфизмов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 среди больных СД 1-го типа и контрольной выборки представлены в таблице 4.

Таблица 4

Частота встречаемости генотипов и аллелей полиморфизмов rs3104413, rs2854275 и rs9273363 в группе больных СД 1-го типа и контрольной выборки

Генотипы, аллели

Больные СД 1-го типа

Контрольная выборка

Х2

OR

(95% CI)

для аллелей

Значимость, p

rs3104413

 

n = 92, абс. (%)

n = 210, абс.(%)

     

С/С

64 (69,6)

76 (36,2)

32,099

4,036

(2,708-6,017)

<0,001*

С/G

16 (17,4)

46 (21,9)

G/G

12 (13,0)

88 (41,9)

С

144 (0,783)

198 (0,471)

49,184

<0,001**

G

40 (0,217)

222 (0,529)

rs2854275

 

n = 92, абс. (%)

n = 122, абс. (%)

     

Т/Т

16 (16,7)

0 (0,0)

88,7

13,8

(7,48-25,46)

<0,001*

G/T

52 (56,3)

14 (11,5)

G/G

24 (27,1)

108 (88,5)

T

84 (44,8)

14 (5,7)

92,41

<0,001**

G

100 (55,2)

230 (94,3)

rs9273363

 

n = 20, абс.(%)

n = 134, абс.(%)

     

А/А

4 (14,3)

2 (1,5)

138,89

76,15

(24,89-233,02)

<0,001*

А/С

22 (78,6)

0 (0,0)

С/С

2 (7,1)

132 (98,5)

А

30 (53,6)

4 (1,5)

128,28

<0,001**

С

26 (46,4)

264 (98,5)

Примечание. Достигнутый уровень значимости при сравнении распределения генотипов (*) и частоты аллелей (**) в группах сравнения 1 и 2. n – численность выборок, Х2 с поправкой Йейтса.

Анализ распределения генотипов показал, что наиболее распространенным генотипом по полиморфизму rs3104413 в группе больных СД 1-го типа является С/С (69,6%), тогда как в контрольной группе чаще встречался гомозиготный вариант G/G (41,1%). В ходе исследования установлено, что преобладающим аллелем полиморфизма rs3104413 в популяции якутов является аллель G (52,9%), при том что в ранее исследованных выборках популяций мира установлено преобладание частоты мутантного аллеля С (78–92%) [5]. Таким образом, мутантный аллель С для якутов может использоваться в качестве маркера повышенного риска развития СД 1 (OR – 4,036; 95% CI: 2,71–6,02; р<0,001).

Выявлено, что самым распространенным генотипом полиморфного варианта rs2854275 в группе контроля является гомозиготный генотип G/G (88,5%), а в группе больных СД 1-го типа – генотип G/Т (56,3%). Анализ отношения шансов показал, что частота встречаемости аллеля Т в группе людей с СД 1-го типа статистически достоверно выше (44,8%), чем среди людей, не страдающих сахарным диабетом 1-го типа (5,7%), что позволяет считать носительство аллеля Т предрасполагающим фактором к развитию СД 1-го типа (OR= 13,8; 95% CI: 7,48–25,46; р<0,001).

Полиморфный вариант rs9273363 характеризовался достоверно низкой частотой аллеля А (1,5%) в группе здоровых индивидов по сравнению с группой больных СД 1-го типа (53,6%). Отношение шансов (OR) риска развития заболевания для носителей аллеля А составило 76,15 (95% CI:24,89–233,02; р<0,001).

Результаты анализа распределения частот генотипов rs3104413 в сочетании с генотипами полиморфизмов rs2854275, rs9273363 среди больных СД 1-го типа и контрольной выборки представлены в таблице 5.

Таблица 5

Частота встречаемости генотипов полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363 среди больных СД 1-го типа и контрольной выборки

Вариант сочетания генотипов, №

rs3104413

rs2854275

rs9273363

Частота в группе СД 1-го типа, абс. (%)

Частота в контрольной группе, абс. (%)

RR

(95% CI)

р

1

С/С

T/T

14 (15,2)

0

3,692

(3,055 – 4,463)

<0,001

2

С/С

G/G

8 (8,7)

68 (32,4)

0,283

(0,144 – 0,557)

<0,001

3

С/С

G/T

42 (45,7)

8 (3,8)

4,234

(3,212 – 5,58)

<0,001

4

G/G

А/С

12 (13)

0

3,625

(3,008 – 4,368)

<0,001

5

G/G

C/C

0

88 (41,9)

0,000

<0,001

6

С/G

G/G

А/А

2 (2,2)

0

3,333

(2,804 – 3,962)

0.170

7

С/G

G/G

А/С

6 (6,5)

0

3,442

(2,881 – 4,113)

0.002

8

С/G

G/G

C/C

0

40 (19)

0,000

<0,001

9

С/G

G/T

C/C

2 (2,2)

4 (1,9)

1,096

(0,349 – 3,444)

0.769

10

С/G

G/T

А/С

4 (4,3)

0

3,386

(2,842 – 4,036)

0.013

11

С/G

G/T

А/А

2 (2,2)

2 (1)

1,656

(0,612 – 4,478)

0.759

Всего выявлено 11 вариантов сочетаний генотипов полиморфизмов rs3104413, rs2854275, rs9273363. В группе больных с СД 1-го типа наиболее часто встречались варианты № 3, 1 и 4, тогда как в группе контроля чаще отмечались № 5, 2 и 8.

Заключение

Наиболее высокими показателями относительного риска среди сочетаний генотипов являлись С/С полиморфизма rs3104413 в сочетании с гетерозиготным генотипом G/T полиморфизма rs2854275 – RR = 4,234 (р<0,001); генотип С/С полиморфизма rs3104413 в сочетании с генотипом Т/Т полиморфизма rs2854275 – RR = 3,692 (р<0,001); генотип G/G полиморфизма rs3104413 в сочетании с генотипом А/С полиморфизма rs9273363 – RR = 3,625 (р<0,001).

Таким образом, полученные данные могут быть использованы в качестве биологических предикторов развития СД 1-го типа с целью проведения своевременных персонализированных профилактических мероприятий.

Исследование было проведено в рамках НИР Изучение генетической структуры и груза наследственной патологии популяций Республики Саха (Якутия).


Библиографическая ссылка

Павлова Н.И., Куртанов Х.А., Дьяконова А.Т., Соловьева Н.А., Сыдыкова Л.А., Александрова Т.Н., Филиппова Н.П., Никифорова М.Е., Додохов В.В. АССОЦИАЦИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА 1-ГО ТИПА С ПОЛИМОРФНЫМИ АЛЛЕЛЯМИ ГЕНОВ HLA КЛАССА II В ПОПУЛЯЦИИ ЯКУТОВ // Современные проблемы науки и образования. – 2019. – № 1.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=28568 (дата обращения: 16.12.2019).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074