Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ НЕКОТОРЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ ВНУТРИДЕРМАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ НАТИВНОЙ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ЖИВОТНЫМ

Галеева А.Г. 1 Капулер О.М. 2 Камилов Ф.Х. 1
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Министерства здравоохранения Российской Федерации «Башкирский государственный медицинский университет»
2 ЗАО «Косметологическая лечебница»
При внутридермальном курсовом введении препарата нативной высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (мол. масса 1 млн Да) методом мезотерапии изучена динамика изменений содержания в сыворотке крови самок белых крыс зрелого возраста (11-12 месяцев) интерлейкина – 1 бета(IL-1β), фактора некроза опухолей – альфа (TNF-α), инсулиноподобного ростового фактора – 1 (IGF-1) и трансформирующего ростового фактора – бета 1 (TGF-β1). Установлено, что в первые дни непосредственно после инъекций наблюдается повышение уровней IL-1β, WF-α, и TGF-β1, что может отражать воспалительную ответную реакцию тканей кожи на процедуру введения. В более отдаленные сроки эксперимента через 2-4 недели после завершения инъекций препарата уровень провоспалительных цитокинов снижается, увеличивается содержание IGF-1, а TGF-β1 сохраняется повышенной, характеризуя усиление процессов пролиферации и активации биосинтетических процессов в области введения гиалуроновой кислоты.
гиалуроновая кислота
внутридермальное введение
интерлейкин - 1β
фактор некроза опухолей – α
инсулиноподобный ростовой фактор – 1
трансформирующий ростовой фактор – β1
1. Калинченко С.Ю., Ворслов Л.О., Тюзиков И.А., Тишова Ю.А. Окислительный стресс как причина системного старения. Роль препаратов α-липовой кислоты (эспа-лимон) в лечении и профилактике возраст-ассоциированных заболеваний // Фарматека. – 2014. - № 6 (279). – С. 43-54.
2. Гунин А.Г., Корнилова Н.К., Петров В.В., Васильева О.В. Возрастные изменения численности и пролиферации фибробластов в коже человека // Успехи геронтологии. – 2011. – Т. 24, № 1. – С. 43-47.
3. Campisi J. Molecular mechanisms of intrinsic aging // Ann.DermatdVenereol. – 2002. – Vol. 129. – P. 110-114.
4. Хабаров Н.В., Байков П.Я., Селянин М.А. Гиалуроновая кислота. – М.: Практическая медицина, 2012. – 224 с.
5. Чайковская Е.А., Шарова А.А. Гиалуроновая кислота и её фрагменты. Биологические функции // Инъекционные методы и композиции. – 2012. – № 1. – С. 9-16.
6. Капулер О., Галеева А., Сельская Б., Камилов Ф. Гиалуронан: свойства и биологическая роль // Врач. – 2015. – № 2. – С. 25-27.
7. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия. – М.: Медицина, 1995. – 224 с.
8. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы её функционирования в норме и при патологии: обзор // Иммунология. – 1997. – № 5. – С. 7-14.
9. Шичкин В.П. Патогенетическое значение цитокинов и перспективы цитокиновой/антицитокиновой терапии: обзор // Иммунология. – 1998. – № 2. – С. 9-13.
10. Сибиряк С.В., Черешнев В.А., Симбирцев А.С. и др. Цитокиновая регуляция биотрансформации ксенобиотиков и эндогенной соединений. – Екатеринбург: УрОРАН, 2006. – 160 с.
11. Симбирцев А.С. Цитокины: классификация и биологическая функция // Цитокины и воспаление. – 2004. – Т. 3, № 2. – С. 16-23.
12. Beutler B. Innato immunity: an overview // Mol. Immunol. – 2004. – Vol. 40, № 12. – P. 845-859.
13. Aggarwal B.B. Signaling pathways of the TNF superfamily: a double – edged sword // Nat. Rev. Imnucnol. – 2003. – Vol. 3, № 9. – P. 745-756.
14. Ярилин Д.А. Роль фактора некроза опухолей в регуляции воспалительного ответа моноцитов и макрофагов // Иммунология. – 2014. – № 4. – С. 195-201.
15. Vallabhapurapu S. Regulation and function of NF – kappa B transcription factors in the immune system // Ann. Rev. Immunol. – 2009. – Vol. 27. – P. 693-733.
16. Bluml S., Scheinecker C., Smolen Y.S., Redlich K. Targeting TNF receptors in rheumatoid arthritis // Int. Immunol. – 2012. – Vol. 24, № 5. – Р. 275-281.
17. Murray P.Y., Wynn T.A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets // Nat. Rev. Immunolog. – 2011. – Vol. 11, № 11. – Р. 723-737.
18. Ivashkiv L.B. Epigenetic requlation of macrophage polarization and function // Trends Immunol. – 2013. – Vol. 34. – P. 216-223.
19. Михайлова Н.П., Шехтер А.Б. Сравнительное исследование взаимодействия инъекционных гелей немодифицированной и модифицированной гиалуроновой кислоты с биотканью // Вестник эстетической медицины. – 2014. – Т. 13, № 3-4. – С. 55-62.
20. Rifkin D.B. Latent transforming growth factor – beta (TGF – beta) binding proteins: orchestrators of TGF-beta availabitity // Y. Biol. Chem. – 2005. – Vol. 280, № 9. – Р. 7409-7412.
21. Compets B.N., Strieter R.M. Fibrocytes in ung diseases // J. Leukoc. Biol. – 2007. – Vol. 82, № 3. – P. 449-456.
22. Sica A., Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas // Y. Clin. Invest. – 2012. – Vol. 122, № 3. - Р. 787-795.
23. Monzani R., Cohen P. IGFs and IGFBPs: role in health and disease. // Best. Pract. Res. Clein. Endocrin. Metab. – 2002. – Vol. 16. – P. 433-447.
24. Planque N. Nuclear trafficking of secreted factors and cell-surface receptors: new pathways to roqulate cell proliferation and differentiation, and involvement in cancers // Cell Commun. Signal. - 2006. – № 4. – Р. 7-14.
25. Hong K.M., Belperla J.A., Keano M.P. Differentation of human circulating fibrocites as mediated by transforming growth factor – β and peroxisome proliferator – activated receptor ɣ // J. Biol. Chem. – 2007. – Vol. 282, № 31. – P. 22910-22920.
26. Fan L., Sebe A., Peterfi Z. et al. Cell contract-dependent regution of epithelial – mesenchimal transition via the Rho-Rho kinase – phosphomyosin pathway // Mol. biol. Cell. – 2007. – Vol. 18. № 3 – P. 1083-1097.
27. Галеева А.Г. Влияние внутридермального введения экспериментальным животным гиалуронана на содержание коллагена в коже // Наука молодых. – 2016. – № 1. – С. 23-27.

Старение – закономерный биологический процесс, сопровождающийся сложными метаболическими, функциональными и структурными изменениями, характеризующийся неуклонным прогрессированием и затрагивающий все уровни биологической организации. Процесс старения нарастает во времени и сопровождается формированием сцепленных с ним болезней и увеличением вероятности смерти. Эти изменения у лиц одного и того же возраста имеют существенные, индивидуальные различия, связанные с особенностями генетического аппарата и его фенотипической реализацией, своеобразием биохимического гомеостаза и нейроэндокринной регуляции, образом жизни, физической активностью, вредными привычками, стрессами, условиями окружающей среды и др.

Население большинства стран Земли быстро стареет: в 1950 г. в возрасте старше 60 лет было лишь 8% мирового населения, в 2000 г. – 10%, а к 2050 г., согласно прогнозу ООН, будет 21% [1], и к настоящему времени становится важным не только продолжительность жизни, но и её качество. Особое влияние на качество жизни оказывает состояние кожи. В отличие от внутренних органов, инволюционные изменения которых происходят достаточно скрытно, возрастные изменения кожи человека обнаруживается относительно рано.  С возрастом кожа дрябнет, она истончается, становится сухой, тусклой, снижаются её тургор и эластичность, появляются морщины, пигментация и другие изменения.

В дерме наблюдается снижение васкуляризации уровня прогениторных мезенхимальных стволовых клеток, что приводит к уменьшению численности биосинтетически активных фибробластов [2]. Как результат понижается продукция таких структурных компонентов внеклеточного матрикса, как гиалуроновая кислота, протеогликаны и фибриллярные белки, необходимых для поддержания тургора, упругости, эластичности, микрорельефа кожи и ее устойчивости к возрастным изменениям. В возрастных изменениях кожи особое внимание привлекает гиалуронан, количество которого в стареющей коже уменьшается [3]. Гиалуронан, благодаря особенностям структуры, связывает воду в межклеточном пространстве, формируя высокогидрофильную среду, определяя тургор, влажность и тонус кожи, обеспечивая диффузию нутриенов и кислорода из дермы в эпидермис [4; 5].

Уникальные физико-химические свойства гиалуроновой кислоты, её биологические функции, биосовместимость и способность взаимодействовать с другими компонентами экстрацеллюлярного матрикса, фибробластами привлекли внимание к возможности использования для коррекции возрастных изменений кожи. Гиалуроновая кислота в дерме не только определяет ряд биомеханических характеристик кожи, но участвует в процессах регуляции деления, дифференцировки, миграции, апоптоза клеток, синтеза и секреции медиаторов воспаления, защиты от окислительного повреждения [4-6]. Не случайно инъекционные и косметические средства на основе гиалуроновой кислоты нашли широкое применение в эстетической медицине. Однако значительный практический опыт их применения основан на констатации визуализируемых изменений кожи, и биохимические механизмы действия препаратов на основе гиалуронана требуют дальнейших исследований.

Цель исследования

Определить динамику изменений интерлейкина – 1 бета, фактора некроза опухолей – альфа, инсулиноподобного ростового фактора 1 и трансформирующего ростового фактора – бета 1 в сыворотке крови при внутридермальном введении экспериментальным животным зрелого возраста нативного высокомолекулярного гиалуронана.

Материал и методы исследования

Исследования проведены на 72 самках белых крыс зрелого возраста (11-12 месяцев) массой 280-320 г с соблюдением международных требований этических норм и рекомендаций по гуманному отношению к животным, используемым в экспериментальных и других научных целях. Крысам опытной группы под лёгким эфирным наркозом вводили препарат Juvederm HydrateTM (Франция), содержащий 13,5 мг геля гиалуроновой кислоты молекулярной массы 1 млн дальтон и 9 мг маннитола в 1 мл фосфатного буфера рН 7,4, из расчета 0,06 мг на 100 г массы тела. Контрольной группе крыс вводили стерильный физиологический раствор хлористого натрия. Инъекции проводили внутридермально техникой мезотерапии на боковые поверхности туловища (площадь 3х3 см) после удаления шерстяного покрова трижды на 1, 3 и 6-е сутки эксперимента. Животных на 2, 4, 7, 21 и 37-е сутки после первой инъекции выводили из опыта декапитацией под лёгким эфирным наркозом. В сыворотке крови определяли содержание интерлейкина – 1 –бета (IL-1β), фактора некроза опухолей – альфа (TNF-α) с использованием наборов реагентов «ИФА-ИЛ-1 β» и «ИФА-ФНО-альфа» ТОО «Протеиновый контур», а также инсулиноподобного ростового фактора 1 (IGF -1) – реагенты IGF ELISA (Mediagnost), трансформирующего ростового фактора бета 1 (TGF-β1) – реагенты TGF-β1 ELISA (Affimetrixe Biosiense), методом твердофазного иммуноферментного анализа на анализаторе Stat Fox 2100 согласно протоколу производителя.

Статистическую обработку результатов осуществили с использованием пакета программы Statistica 6 for Windows c расчетом медианы, верхнего и нижнего квартилей. Межгрупповые различия показателей оценивали по U-критерию Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Содержание определяемых в сыворотке крови животных изучаемых цитокинов представлено в таблице. Уровень провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α в первую неделю опыта на следующие дни после введения препарата гиалуроновой кислоты (2, 4 и 7-е сутки) повышался, а в более отдаленные сроки, через 2-4 недели после завершения курсовой инъекции, не отличался от контрольных значений. 

Содержание цитокинов в сыворотке крови самок крыс зрелого возраста при внутридермальном введении препарата гиалуронана

Цитокины

Контрольная

группа, n=14

Опытная группа

2-е сут.,

n=8

4-е сут.,

n=10

7-е сут.,

n=10

21-е сут.,

n=10

37-е сут.,

n=10

IL-1β,

пг/мл

28,3

[25,6-34,3]

35,4*

[30,3-47,6]

34,6*

[31,0-41,4]

36,2*

[28,6-45,4]

30,8

[28,6-45,4]

27,5

[22,7-29,7]

TNF-α,

пг/мл

13,3

[10,6-17,2]

16,8*

[15,4-23,6]

16,4*

[114,9-25,1]

16,5*

[15,0-24,1]

14,1

[11,2-18,5]

14,5

[12,3-20,4]

IGF-1,

пг/мл

124

[88-153]

118

[85-136]

142

[98-152]

158

[125-164]

184*

[166-188]

202*

[171-223]

TGF-β1,

пг/мл

3,25

[2,56-4,01]

4,8**

[4,21-4,93]

3,95*

[3,61-4,12]

4,78**

[4,6-4,99]

3,99*

[3,52-4,3]

4,08*

[3,87-4,48]

Примечание: * - Р<0,05; ** - Р<0,01 по сравнению с контролем.

IL-1β и TNF-α являются плейотропными медиаторами воспаления. IL-1β многофункциональный цитокин с широким спектром действия, играет роль в развитии и регуляции неспецифической защиты и специфического иммунитета, включается одним из первых в ответную защитную реакцию при действии стрессорных факторов. Основными продуцентами IL-1β являются макрофаги и моноциты, хотя может вырабатываться иммунокомпонентными, эпителиальными и эндотелиальными клетками, фибробластами и др. Клетками-мишенями являются иммунокомпетентные, эндотелиальные и эпителиальные клетки, кератиноциты, гепатоциты, фибробласты и др. Он инициирует и регулирует воспалительные и иммунные процессы, активирует нейтрофилы, лимфоциты, стимулирует синтез провоспалительных цитокинов (IL-2,-3,-6,TNF-α), молекул адгезии, простагландитов, белков острой фазы, индуцирует образование  активных форм кислорода, повышает проницаемость сосудистой стенки [7-12].  

Многие функции TNF-α идентичны функциям IL-1. Особенно интенсивно и достаточно быстро вырабатывается активированными мононуклеарными фагоцитами. Его могут продуцировать также фибробласты, дендритные клетки, тучные клетки, Т-лимфоциты, гемопоэтические и эндотелиальные клетки [13]. Он индуцирует синтез простациклина (простагландина I2), экспрессию молекул адгезии (ELAM-1, ICAM-1) и мембранно-ассоциированного IL-1, повышает секрецию IL-2, IL-6, IL-8, гранулоцито-макрофагального  колонийстимулирующего фактора (GM-CSF), моноцитарного хемотоксического белка и др. [7; 14]. TNF участвует и регулирует множество биологических процессов, включая воспалительную реакцию, пролиферацию, дифференцировку и гибель различных клеток, врождённый и приобретенный иммунитет. Рецепторы к TNF – TNFR 1/p55 иTNFR2/p75 экспрессируются большинством клеток. Связывание цитокина с рецепторами включает сигнальные каскады, ведущие к активации митогенактивируемых протеинокиназ и транскрипционных факторов, включая ядерный фактор каппа би (NFkB) активирующий протеин, которые регулируют экспрессию генов – медиаторов воспаления [15; 16], вызывает также экспрессию протоонкогенов с-myc, с-fos и c-jun [7]. TNF-α индуцирует поляризацию М1-фенотипа макрофагов, вырабатывающих воспалительные цитокины, простациклин, антимикробные молекулы и активные формы кислорода [17; 18]. IL-1β и TNF-α действуют синергично на фибробласты, стимулируя их пролиферацию, активируя метаболические процессы в соединительной ткани, что важно для восстановления целостности ткани после повреждений [14].

Повышение уровня IL-1β и TNF-α в первые дни после введения гиалуроновой кислоты, вероятно, связано с развитием воспалительной реакции ткани кожи на процедуру внутридермальной инъекции. При субдермальном введении экспериментальным животным нативной и модифицированных форм гиалуроновой кислоты наблюдался воспалительный ответ на повреждение, который сопровождался умеренной нейтрофильной инфильтрацией, сменяющейся в динамике на лимфоцитарно-макрофагальную [19].

Увеличение содержания TGF-β1, установленного в первые дни наших экспериментов, по всей вероятности, тоже связано с реакцией воспалительного ответа кожи на внутридермальное введение препарата гиалуроновой кислоты. TGF-β1 является членом суперсемейства трансформирующего ростового фактора, насчитывающего около 100 представителей, действует на клетки через рецепторы – серин/треонинпротеинкиназы, использует SMAD – синтез внутриклеточного распространения сигналов [20]. Он также продуцируется активированными макрофагами, Т-лимфоцитами, фибробластами, фиброцитами [21]. Однако при этом TGF-β1 оказывает противовоспалительный эффект, подавляя синтез провоспалительных цитокинов и ответ лимфоцитов на действие IL-2,-4,-7, формирование цитоксических NK-и T-клеток, снижает цитотоксическую и цитокинпродуцирующую активность моноцитов/макрофагов. TGF-β1 индуцирует макрофаги М2-фенотипа, экспрессирующие ростовые факторы и ингибиторы воспаления, необходимые для разрешения воспаления, восстановления и заживления [22]. Несмотря на плейотропный характер эффектов, основное действие TGF-β1 направлено на стимулирование пролиферации и роста клеток.

К группе сигнальных молекул, основное действие которых направлено на стимулирование пролиферации и роста клеток, хотя также обладает плейотропным характером эффекта, относится IGF-1 [23]. По структуре IGF-1 близок к инсулину (43% гомологии), продуцируется гепатоцитами, клетками соединительной и других тканей (в основном под контролем гормона роста), обладает прямым эффектом in vivo и in vitro, относится к аутокринно–парокринным факторам. Своё действие оказывает через рецептор IGFR-1 и частично через рецептор инсулина IR. Его взаимодействие с рецептором, обладающим тирозинкиназной активностью, включает в дальнейшем активацию (фосфоримирование) допинг–белков нескольких путей интерцеллюлярного распространения сигналов, приводящих к стимуляции клеточной дифференцировки и пролиферации [24]. Уровень IGF-1 в сыворотке крови в первые дни эксперимента (2, 4, 7-е сутки) не подвергался статически значимым колебаниям, и повышение его содержания обнаруживалось в более отдалённые сроки – на 21-е и 37-е сутки опыта, и его увеличение может быть косвенным отражением стимуляции процессов пролиферации и роста клеток кожи в зоне введения гиалуронана.

Об этом свидетельствует и сохранение повышенного содержания в сыворотке крови TGF-β1 на 21-е и 37-е сутки эксперимента. Под влиянием TGF-β1 происходит активная дифференциация циркулирующих фиброцитов в репаративные фибробласты [25], трансдифференциация клеток эктодермального происхождения также в репаративные фибробласты [26], интенсивно продуцирующие коллаген и другие компоненты внеклеточного матрикса. При введении геля гиалуроновой кислоты в кожу экспериментальных животных на фоне интенсивной резорбции гиалуроновой кислоты активизировалась  пролиферация фибробластов и процессы неоангиогенеза [19], увеличение содержания в коже нейтральносолерастворимой фракции и суммарного коллагена [27].

Заключение

Внутридермальное введение высокомолекулярной нативной гиалуроновой кислоты методом мезотерапии приводит у животных зрелого возраста в первые дни после процедуры инъекций к усилению секреции IL-1β, TNF-α и TGF-β1, что может отражать воспалительную ответную реакцию ткани кожи. В отдаленные сроки, через 2-4 недели после мезотерапии, уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке крови снижается, увеличивается продукция IGF-1, а TGF-β1 сохраняется повышенным, характеризуя усиление процессов пролиферации и активации биосинтетических процессов в области инъекции препарата гиалуронана.


Библиографическая ссылка

Галеева А.Г., Капулер О.М., Камилов Ф.Х. ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ НЕКОТОРЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ ВНУТРИДЕРМАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ НАТИВНОЙ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ЖИВОТНЫМ // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27262 (дата обращения: 27.09.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074