Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

МЕХАНИЗМ ВЛИЯНИЯ ЭРИТРОПОЭТИНА НА КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ В КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ

Осиков М.В. 1 Симонян Е.В. 1 Саедгалина О.Т. 1 Федосов А.А. 1
1 ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Лимфоцитопения и вторичный иммунодефицит при термической травме (ТТ) являются причиной гнойно-септических осложнений и высокой летальности. Обнаруженные ранее иммунотропные свойства эритропоэтина (ЭПО) при патологии почек позволяют предположить их наличие при ТТ. Исследование выполнено на 90 белых нелинейных половозрелых крысах. ТТ IIIА степени и площадью 4 % моделировали путем погружения участка межлопаточной области крысы в очищенную воду с температурой 98–99 оС. ЭПО («Эпостим», МНН: эпоэтин бета, ООО «Фармапарк», Россия) вводили в дозе 500 МЕ/кг ежедневно, суммарная доза составила 4000 МЕ/кг. Исследования проводили на 3 и 8 сутки. Методом проточной цитофлуориметрии определяли количество в крови СD3+, СD45RA+ лимфоцитов, апоптоз лимфоцитов при окрашивании клеток аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD). Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в гептановой и в изопропанольной фазах липидного экстракта лимфоцитов с дифференцировкой первичных продуктов (Е232/Е220, диеновые конъюгаты), вторичных продуктов (Е278/Е220, кетодиены и сопряженные триены), конечных продуктов (Е400/Е220, Шиффовы основания). Установлено, что при ТТ на 3 и 8 сутки снижается количество CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в крови, увеличивается количество лимфоцитов с ранними признаками апоптоза, поздними признаками апоптоза, признаками некроза, происходит накопление первичных продуктов ПОЛ в гептановой фазе, вторичных и конечных продуктов ПОЛ в гептановой и в изопропанольной фазах липидного экстракта лимфоцитов периферической крови. Применение при ТТ ЭПО приводит к восстановлению на 3 сутки и увеличению на 8 сутки количества CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в крови, снижению на 8 сутки количества лимфоцитов с ранними признаками апоптоза, поздними признаками апоптоза, признаками некроза. Применение ЭПО при ТТ оказывает ПОЛ-ограничивающий эффект в гептановой и в изопропанольной фазах липидного экстракта лимфоцитов периферической крови.
перекисное окисление липидов
апоптоз
лимфоциты
термическая травма
эритропоэтин
1. Осиков М. В. Анализ эфферентных свойств церулоплазмина и альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном перитоните / М. В. Осиков, Л. В. Кривохижина, А. В. Малъцев // Эфферентная терапия. – 2006. – Т. 12, № 4. – С. 36-39.
2. Осиков М. В. Реактивные изменения клеточно-гуморальной системы организма как типовой патологический процессии его регуляция реактантами острой фазы : автореф. дис. … д-ра мед. наук. – Челябинск, 2008. – 44 с.
3. Осиков М. В. Роль орозомукоида в регуляции активности систем плазменного протеолиза при экспериментальной почечной недостаточности / М. В. Осиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 148, № 7. – С. 27-30.
4. Осиков М. В. Патофизиологический анализ влияния эритропоэтина на психологический статус у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М. В. Осиков, К. В. Ахматов, Л. В. Кривохижина // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. – 2010. – № 19 (195). – С. 110-116.
5. Осиков М. В. Роль эритропоэтина в коррекции нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности / М. В. Осиков, Т. А. Григорьев // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 9-3. – С. 462-466.
6. Осиков М. В. К вопросу о механизме влияния эритропоэтина на аффективный статус у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М. В. Осиков, К. В. Ахматов, А. А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 7-1. – С.140-145.
7. Осиков М. В. Влияние эритропоэтина на активность систем плазменного протеолиза при экспериментальной почечной недостаточности / М. В. Осиков, Т. А. Григорьев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 153, № 1. – С. 27–30.
8. Осиков М. В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов / М. В. Осиков, Т. А. Григорьев, А. А. Федосов и др. // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=7450 (дата обращения: 06.03.2016).
9. Осиков М. В. Роль эритропоэтина в реализации тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови при хронической почечной недостаточности / М. В. Осиков, Т. А. Григорьев, А. А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 10-2. – С. 285-289.
10. Ghanime G. Epidemiology of major burns at the Lebanese burn center in geitawi, Lebanon. / G. Ghanime, N. Rizkallah, J.M. Said // Ann. burns fire disasters. – 2013. – Vol. 26, № 2. – P. 59-62.

Ожоги представляют глобальную медико-социальную проблему. По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно страдают от ожогов различной степени тяжести более 6,6 млн человек. На долю термической травмы приходится большая часть ожогов: воздействие огнем 55 %, горячей водой 40 %. В России ежегодно регистрируется более 400 тысяч случаев смерти от ожогов. Высокая летальность обусловлена сложностью и многообразием патогенетических механизмов, лежащих в основе развития, течения и исхода термической травмы [10]. Центральную роль в патогенезе термической травмы занимает развитие системного воспалительного ответа на повреждение, вторичного иммунодефицита за счет гибели иммунокомпетентных клеток путем некроза и/или апоптоза. Это приводит к риску развития инфекционных осложнений, полиорганной недостаточности и в тяжелых случаях – к смерти. Поэтому актуальным является поиск новых средств и иммунокоррегирующих подходов для терапии ТТ. В последнее время интерес многих ученых направлен на изучение регуляторов гомеостаза эндогенной природы [1-3]. В частности, ранее нами в клинических и в экспериментальных условиях при различной патологии продемонстрированы протекторные свойства эритропоэтина (ЭПО), в том числе в связи с иммуномодулирующим действием [4-9]. Полагаем, что ЭПО может оказывать иммунотропные эффекты при ТТ за счет изменения гибели лимфоцитов в периферической крови. Цель работы – исследовать некоторые механизмы влияния эритропоэтина на популяционный спектр лимфоцитов в крови при экспериментальной термической травме.

Материалы и методы исследования. Эксперимент выполнен на 90 белых нелинейных половозрелых крысах массой 250±20 г. при строгом соблюдении требований Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. Все животные случайным образом были разделены на 3 группы: 1 группа – интактные (n=10), 2 группа – крысы с ТТ (n=40), 3 группа – крысы с ТТ, которым внутрибрюшинно вводили ЭПО (n=40). ТТ IIIА степени и площадью 4 % моделировали путем погружения участка межлопаточной области крысы в очищенную воду с температурой 98–99 оС на 12 с. Глубину ожога верифицировали при гистологическом исследования микропрепаратов кожи на микроскопе «Leika DMRXA» (Германия) с помощью компьютерной программы анализа изображений «ImageScope M» (Россия, Москва). ЭПО («Эпостим», международное непатентованное название: эпоэтин бета, ООО «Фармапарк», Россия) вводили в дозе 500 МЕ/кг ежедневно, суммарная доза введенного ЭПО на конец исследования составила 4000 МЕ/кг. Во 2 и 3 группах ежедневно проводили перевязки с наложением асептической повязки на область ожоговой раны. Кровь получали пункцией левого желудочка сердца под внутривенным наркозом «Золетилом» (тилетамин и золазепам, «ВирбакСантеАнималь», Франция). Исследования проводили на 3 и 8 сутки. Лимфоциты из периферической крови выделяли общепринятым методом на градиенте плотности фиколл-верографина 1,077. Определение популяционного спектра лимфоцитов периферической крови (СD3+, СD45+) осуществляли с помощью проточного цитофлуориметра «Navios» («BeckmanCoulter», США) с использованием специфических крысиных моноклональных антител производителя «ELISAKit» (Китай). Апоптоз лимфоцитов оценивали при окрашивании клеток конъюгированным с флюорохромоманнексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) из набора «Annexin 5 – FITC/7-AADkit» («BeckmanCoulter», США) на проточном цитофлуориметре. Дифференцировали интактные клетки (Annexin-5-FITC–/7-AAD–), клетки с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD–), клетки с поздними признаками апоптоза и частично некротические клетки (Annexin-5-FITC+/7-AAD+). Результат выражали в %. Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в гептановой (г) и в изопропанольной (и) фазах липидного экстракта лимфоцитов по методу Волчегорского И. А. и соавт. Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.): Е232/Е220 (первичные продукты ПОЛ – диеновые конъюгаты), Е278/Е220 (вторичные продукты ПОЛ – кетодиены и сопряженные триены) и Е400/Е220 (конечные продукты ПОЛ – Шиффовы основания). Результаты обрабатывали с использованием программы «Statistica 10.0 for Windows». Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критериев Манна – Уитни, Вальда – Вольфовитца, Крускела – Уоллиса.

Результаты исследования и их обсуждение. Установлено, что при ТТ на 3 сутки эксперимента при исследовании популяционного спектра лимфоцитов крови содержание CD3+ лимфоцитов статистически значимо не изменяется, на 8 сутки наблюдается значимое почти двукратное снижение количества CD3+ клеток в крови (таблица 1).

Таблица 1

Влияние эритропоэтина на количественный состав лимфоцитов в периферической крови при термической травме (M±m)

Показатели

Группа 1

Интактные

(n=10)

Группа 2а

ТТ

3 сутки

(n=10)

Группа 3а

ТТ+ЭПО

3 сутки

(n=10)

Группа 2b

ТТ

8 сутки

(n=10)

Группа 3b

ТТ+ЭПО

8 сутки

(n=10)

CD3+,

109

3,14±0,12

 

2,94±0,31

 

4,10±0,56

р2a-3a<0,01

1,62±0,38

р1-2b<0,01

8,50±1,84

р2b-3b<0,01

р1-3b<0,01

CD45RA+, 109

2,22±0,14

 

1,54±0,27

р1-2а<0,01

2,51±0,35

р2a-3a<0,01

0,90±0,07

р1-2b<0,01

5,34±0,92

р2b-3b<0,01

р1-3b<0,01

Примечание. Здесь и далее р – показатель значимости различий между группами по критериям Манна – Уитни, Вальда – Вольфовитца, Крускела – Уоллиса.

Количество CD45RA+ лимфоцитов снижается на 3 и 8 сутки ТТ. Полученные данные позволяют констатировать снижение представительства в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы Т-лимфоцитов (CD3+) и преимущественно В-лимфоцитов (CD45RA+).

При исследовании гибели лимфоцитов в периферической крови путем апоптоза и некроза при ТТ выявлено, что количество клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-) прогрессивно увеличивается на 3 и 8 сутки эксперимента, так как количество лимфоцитов с данным фенотипом на 8 сутки значимо больше количества на 3 сутки ТТ (таблица 2). Содержание лимфоцитов с поздними признаками апоптоза, признаками некроза (Annexin-5-FITC+/7-AAD+) также прогрессивно увеличивается на 3 и 8 сутки эксперимента относительно группы интактных животных. Как следствие, количество интактных лимфоцитов прогрессивно снижается от 3 к 8 суткам ТТ.

Содержание при ТТ продуктов ПОЛ в липидном экстракте лимфоцитов периферической крови в гептановой фазе, которая концентрирует основную часть триацилглицеридов (резервных липидов), и в изопропанольной фазе, содержащей мембранные фосфолипиды, представлено в таблице 3. Как видно, на 3 сутки эксперимента возрастает количество диеновых конъюгатов, кетодиентов и сопряженных триенов в гептановой фазе и оснований Шиффа в изопропанольной фазе липидного экстракта лимфоцитов. К 8 суткам ТТ в гептановой фазе сохраняется повышенным содержание диеновых конъюгатов в гептановой фазе и оснований Шиффа в изопропанольной фазе. Кроме этого, на 8 сутки ТТ увеличивается содержание оснований Шиффа в гептановой фазе и кетодиентов и сопряженных триенов в изопропанольной фазе липидного экстракта лимфоцитов.

Полагаем, что окислительный стресс при ТТ, инициирующим звеном которого в периферической крови выступают активированные фагоциты, эндотелиоциты, тромбоциты, приводит к активации процессов пероксидации липидов мембран клеток крови, в том числе лимфоцитов, следствием чего является накопление продуктов ПОЛ в лимфоцитах периферической крови. Повреждение цитоплазматической мембраны и мембран органелл лимфоцитов запускает процесс гибели лимфоцитов в периферической крови путем некроза и/или апоптоза и приводит к снижению представительства Т-лимфоцитов (CD3+) и преимущественно В-лимфоцитов (CD45RA+). Таким образом, одним из звеньев патогенеза вторичного иммунодефицита при ТТ выступает лимфоцитопения, развивающаяся вследствие гибели лимфоцитов периферической крови, инициированной окислительным стрессом.

Применение ЭПО при ТТ приводит к восстановлению количества CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в периферической крови на 3 сутки эксперимента (таблица 1). На 8 сутки ТТ количество и CD3+, и CD45RA+ лимфоцитов в периферической крови становится более чем в 2 раза выше, чем в группе интактных животных.

Исследование интенсивности гибели лимфоцитов в крови при ТТ в условиях введения ЭПО показало, что на 3 сутки количество интактных клеток, клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза, признаками некроза статистически значимо не отличается от группы сравнения (таблица 2). Отметим, что при сравнении с группой интактных животных на 3 сутки ТТ было увеличено только количество лимфоцитов с поздними признаками апоптоза, признаками некроза. На 8 сутки ТТ применение ЭПО приводит к снижению количества клеток с ранними признаками апоптоза, с поздними признаками апоптоза, признаками некроза до значений в группе интаткных животных. Как следствие, наблюдается увеличение количества интактных клеток.

Таблица 2

Влияние эритропоэтина на показатели гибели лимфоцитов периферической крови при термической травме (M±m)

Показатели

Группа 1

Интактные

(n=10)

Группа 2а

ТТ

3 сутки

(n=10)

Группа 3а

ТТ+ЭПО

3 сутки

(n=10)

Группа 2b

ТТ

8 сутки

(n=10)

Группа 3b

ТТ+ЭПО

8 сутки

(n=10)

Annexin-5-FITC-/7-AAD-, % клеток

93,16±0,16

88,38±2,26

р1-2а<0,01

91,62±1,85

66,56±5,60

р1-2b<0,01

р2a-2b<0,01

91,94±0,80

р2b-3b<0,01

 

 

Annexin-5-FITC+/7-AAD-, % клеток

6,66±0,79

10,74±2,07

р1-2а<0,01

7,69±1,59

22,26±1,89

р1-2b<0,01

р2a-2b<0,01

7,90±0,77

р2b-3b<0,01

 

Annexin-5-FITC+/7-AAD+, % клеток

0,16±0,04

0,82±0,17

р1-2а<0,01

0,62±0,28

р1-3a<0,01

 

10,70±3,90

р1-2b<0,01

р2a-2b<0,01

0,14±0,05

р2b-3b<0,01

 

 

Применение ЭПО при ТТ приводит на 3 сутки наблюдения к снижению содержания диеновых конъюгатов в гептановой фазе липидного экстракта лимфоцитов периферической крови, количество других продуктов ПОЛ значимо не отличается от группы животных с ТТ (таблица 3). На 8 сутки эксперимента в условиях применения ЭПО в гептановой фазе липидного экстракта лимфоцитов периферической крови снижается содержание диеновых конъюгатов и оснований Шиффа, в изопропанольной фазе снижается содержание кетодиентов и сопряженных триенов, а также оснований Шиффа.

Таблица 3

Влияние эритропоэтина на содержание продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта лимфоцитов периферической крови при термической травме (M±m)

Показатели

Группа 1

Интактные

(n=10)

Группа 2а

ТТ

3 сутки

(n=10)

Группа 3а

ТТ+ЭПО

3 сутки

(n=10)

Группа 2b

ТТ

8 сутки

(n=10)

Группа 3b

ТТ+ЭПО

8 сутки

(n=10)

ДК (г), е.и.о.

0,25±0,03

0,77±0,03

р1-2а<0,01

 

0,35±0,07

р2a-3a<0,01

0,77±0,10

р1-2b<0,01

0,40±0,07

р2b-3b<0,01

КД и СТ (г), е.и.о.

0,204±0,011

0,32±0,03

р1-2а<0,01

0,31±0,08

0,19±0,07

0,106±0,060

р2b-3b<0,01

ШО (г), е.и.о.

0,017±0,005

0,150±0,047

 

0,035±0,013

0,162±0,049

р1-2b<0,01

0,026±0,009

р2b-3b<0,01

ДК (и), е.и.о.

0,86±0,24

1,03±0,05

 

0,96±0,09

0,97±0,15

1,13±0,04

КД и СТ (и), е.и.о.

0,12±0,03

0,13±0,03

0,14±0,02

0,17±0,01

0,11±0,01

р2b-3b<0,01

ШО (и), е.и.о.

0,035±0,010

0,070±0,019

р1-2а<0,01

 

0,114±0,057

0,052±0,019

р1-2b<0,01

0,018±0,007

р2b-3b<0,01

Примечание. Содержание продуктов ПОЛ в гептановой (г) и в изопропанольной (и) фазах липидного экстракта лимфоцитов.

Таким образом, нами при ТТ зафиксирован ПОЛ-ограничивающий эффект ЭПО в лимфоцитах периферической крови. Ограничение повреждения клеток свободными радикалами приводит к уменьшению их гибели путем апоптоза или некроза и, как следствие, восстановлению количественного представительства в кровотоке. Однако, учитывая установленный раннее факт значительного увеличения количества Т- и В-лимфоцитов в крови на 8 сутки ТТ в условиях применения ЭПО, может предположить стимулирующий эффект ЭПО в отношении пролиферации и дифференцировки клеток в ходе лимфопоэза в костном мозге, других органах иммунной системы.

Цитопротекторное действие ЭПО может реализоваться как напрямую, так и опосредованно за счет воздействия на ферменты антиоксидантной защиты, способствующих снижению количества активных форм кислорода. Ранее нами было установлено, что ЭПО повышает активность ферментов антиокислительной защиты в эритроцитах [5, 8]. По данным некоторых авторов, при связывании ЭПО с специфическими рецепторами на цитоплазматической мембране запускаются сигнальные пути, в том числе при участии активаторов транскрипции (STAT-5, STAT-3), которые приводят к активации генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток.

Выводы

  1. Установлено, что при экспериментальной термической травме на 3 и 8 сутки наблюдения происходит снижение количества CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в периферической крови, увеличивается количество лимфоцитов в крови с ранними признаками апоптоза, поздними признаками апоптоза, признаками некроза. При ТТ происходит накопление первичных продуктов перекисного окисления липидов в гептановой фазе, вторичных и конечных продуктов перекисного окисления липидов в гептановой и в изопропанольной фазах липидного экстракта лимфоцитов периферической крови.
  2. Применение при термической травмеэритропоэтина в дозе 500 МЕ/кг ежедневно приводит к восстановлению на 3 сутки и увеличению на 8 сутки количества CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в периферической крови, снижению на 8 сутки количества лимфоцитов в крови с ранними признаками апоптоза, поздними признаками апоптоза, признаками некроза. Применение ЭПО при ТТ оказывает ПОЛ-ограничивающий эффект в гептановой и в изопропанольной фазах липидного экстракта лимфоцитов периферической крови.

Библиографическая ссылка

Осиков М.В., Симонян Е.В., Саедгалина О.Т., Федосов А.А. МЕХАНИЗМ ВЛИЯНИЯ ЭРИТРОПОЭТИНА НА КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ В КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 2.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=24275 (дата обращения: 15.11.2019).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074