Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

КОНТАКТНАЯ АТОМНО-СИЛОВАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ С ЧАСТЫМИ ОБОСТРЕНИЯМИ

Гайнитдинова В.В. 1 Шарафутдинова Л.А. 2 Бакиров А.Б. 1 Калимуллина Д.Х. 1
1 ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России
2 Башкирский государственный университет
С использованием метода атомно-силовой микроскопии проведено исследование вязко-упругих свойств (жесткости мембраны, силы адгезии) нейтрофилов периферической крови у больных с частыми обострениями хронической обструктивной болезни легких. В режиме силовой спектроскопии выполнена количественная оценка модуля упругости (модуля Юнга) клеточной мембраны и силы адгезии нейтрофилов. В серии экспериментов сравнивались показатели жесткости и силы адгезии мембраны нейтрофилов, полученных из крови здоровых доноров и больных ХОБЛ. Установлено, что клеточная мембрана нейтрофилов больных ХОБЛ с частыми обострениями по сравнению с контрольной группой и группой больных с редкими обострениями характеризуется более высокой жесткостью, характеризуемой высокими значениями модуля Юнга и повышенной силой адгезии нейтрофилов. Выявлена зависимость исследуемых от показателей функции внешнего дыхания и частоты обострений
сила адгезии нейтрофилов
жесткость мембраны нейтрофилов
атомно-силовая микроскопия
частые обострения
хроническая обструктивная болезнь легких
1. Авдеев С.Н. Ингибиторы фосфодиэстеразы - 4: новые перспективы противовоспалительной терапии ХОБЛ // Фарматека. – 2013. - № 4. – С. 101-111.
2. Подосинников И.В., Нилова Л.Г. Бабичев И.В. Метод определения хемотаксической активности лейкоцитов // Лаб. Дело. - 1981. - № 8. - C. 68-70.
3. Российское респираторное общество. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению хронической обструктивной болезни легких. – М., 2013.
4. Bailey, K.L. The Role of Systemic Inflammation in COPD / K.L.Bailey, J. Goraya, S.L. Rennard// Chronic Obstructive Pulmonary Disease Co-Morbidities and Systemic Consequences Series/ eds.L.Nici, R. ZuWallack. –Humana Press, 2012.–Vol. XII. - 288 p.
5. Barnes PJ, Celli BR. Systemic manifestations and comorbidities of COPD// EurRespir J. -2009. Vol.-33. – P. 1165–1185
6. Blidberg K., Palmberg L., Jameet A. Adhesion molecule sin subjects with COPD and healthynon-smokers: a cross sectional parallel group study // Respir. Res. – 2013. Vol. 14. – P. 47.
7. Bukharaev A.A., Mozhanova A.A., Nurgazizov N.I., Ovchinnikov D.V. Measuring local elastic properties of cell surfaces and soft materials in liquid by AFM // Physic of low-dimension structures. - 2003. – P. 31—38.
8. Emiel F.M. Wouters Local and Systemic Inflammation in Chronic Obstructive Pulmonary Disease // Proc. Am. Thorac. – 2005. Vol. 2. – P. 26–33.
9. Fritz M.E. Ter-Minassian Franssen and Carolyn L. Rochester, Comorbidity in patients with chronic obstructive lung disease and pulmonary rehabilitation: do they matter?// Eur Respir J. - 2014. Vol. 131. - P 131-141.
10. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD). Global strategy for diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO workshop report. – URL: www.goldcopd.org (Last updated 2014).
11. Hoogendoorn M., Hoogenveen R.T., Rutten-van Mo.lken M.P., Vestbo J., Feenstra T.L., Case fatality of COPD exacerbations: a meta-analysis and statistical modeling approach// EurRespir J. - 2011. Vol. 37. – P. 508–515.
12. Navessa P. Tania, Martina Schmidt and Reinoud Gosens Activin-A: active in inflammation in COPD// Eur Respir J. – 2014. Vol. 43. – P. 954–955.
13. Noguera A., Batle S., Miralles C. et al. Enhanced neutrophil response in chronic obstructive pulmonary disease // Thorax. – 2001. Vol. 56, N 6. – P. 432–437.
14. Roca-Cusachs P., Almendros I., SunyerRaimon et al. Rheology of Passive and Adhesion-Activated Neutrophils Probed by Atomic Force Microscopy // Biophys. J. – 2006. Vol. 91. – P. 3508–3518.

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) характеризуется прогрессирующим не полностью обратимым ограничением потока воздуха [10,12]. Выраженность симптомов при ХОБЛ варьирует в зависимости от фазы течения заболевания (стабильное течение или обострение). Обострения ухудшают функцию внешнего дыхания, а частота обострений напрямую влияет на продолжительность жизни больных и требует индивидуального подхода к лечению [3,11].

Воспаление дыхательных путей является основным компонентом в патогенезе ХОБЛ [1]. Согласно результатам многочисленных исследований у больных ХОБЛ имеют место изменения структуры и активация нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови [8]. При этом наблюдается нарушение функционирования циркулирующих нейтрофилов, что способствует развитию системного воспалительного ответа. Кроме того, нейтрофилы у больных ХОБЛ обладают повышенной хемотаксической реакцией, усиленной способностью переваривать соединительную ткань [13] и повышенной экспрессией поверхностных клеточных адгезивных молекул [6]. Системное воспаление, в свою очередь, может способствовать развитию системных проявлений ХОБЛ, включая сердечно-сосудистые заболевания, рак легких, потерю веса, остеопороз и диабет [4,5,9].

Одним из перспективных методов изучения структурно-механических свойств клеток крови в настоящее время является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Важным преимуществами АСМ по сравнению с другими методами исследования клеток крови являются возможность изучения реальной поверхности клетки без применения специальных методов подготовки образцов и использование АСМ в качестве наномеханического сенсора, позволяющего изучать механические (упругие) и адгезионные свойства биоматериалов[14].

В связи с вышесказанным, целью работы явилось исследование вязко-упругих свойств (жесткости мембраны, силы адгезии) нейтрофилов периферической крови у больных с частыми обострениями ХОБЛ с помощью атомно-силовой микроскопии.

Материалы и методы исследования. В исследование включено 24 пациента ХОБЛ. Из них 12 человек с частыми обострениями (2 или более обострения в год, или 1 и более обострений, приведших к госпитализации, GOLD 2014 г), 12 человек с редкими обострениями (0-1 обострений в год , GOLD 2014 г). Группы статистически значимо не различались (p>0,05) по возрасту, половой принадлежности, тяжести заболевания (GOLD 2014г), частоте обострения за последние 2-3 года. Диагноз ХОБЛ установлен согласно рекомендациям GOLD 2013г. Средний возраст больных в исследуемых группах составил 53,3 ± 5,2 и 52,3 ± 1,6 лет. Средняя продолжительность заболевания - 8,90 ± 3,9 лет и 9,70 ± 3,4 лет, частота обострений 0,98 ± 0,11 и 2,88 ± 0,7 в год соответственно. Выраженность одышки по mMRS и CAT в среднем составляла 2,87±1,74 баллов и 26,89±4,04баллов в группе больных с редкими обострениями, в группе больных с частыми обострениями - 3,03 ±2,20 баллов и 28,06±5,03 баллов соответственно. В контрольную группу вошли 14условно здоровых лиц без патологии органов дыхания в возрасте 45-55 лет. Критерии исключения из исследования былиострые формы других инфекционно-воспалительных, нагноительных заболеваний, лихорадка, злокачественные новообразования.

В комплекс обязательного обследования входили общие исследования крови при поступлении. Для определения выраженности одышки использовали шкалу CAT (COPDA ssessment test) и опросник mMRC (Medical Research Council). Индексы курения (ИК) и массы тела (ИМТ) высчитывали по общепринятым формулам. Насыщение крови кислородом (Sa О2) определялось с помощью напалечного пульсоксиметра MD300C. Всем пациентам проведено функциональное исследование респираторной, сердечно-сосудистой систем, определен уровень СДЛА. Спирометрия (ОФВ1, ФЖЕЛ, отношение ОФВ1/ФЖЕЛ), бодиплетизмография (ООЛ, ОЕЛ, ДСЛ, АВ) проводились на оборудовании MasterScreenBody (ErichJaeger, Германия). Специальные методы: Объектом исследования послужили нейтрофилы периферической крови больных ХОБЛ. Забор крови проводился в 1-е сутки поступления пациентовв стационар до назначения антибактериальной терапии, системных глюкокортикостероидов (СГКС). Нейтрофилы выделялиcь из гепаринизированной (20 ед / мл) венозной крови доноров на двойном градиенте фиколл-урографина по методике И.В. Подосинникова и соавт. [2]. Клетки дважды отмывались забуференным изотоническим раствором натрия хлорида и взвешивались в растворе Хенкса. Оценка упругих свойств мембраны нативных нейтрофилов проводилась в режиме силовой спектроскопии. Исследования поверхности клеток проводилось в жидкостной ячейке на АСМ Agilent 5500 с использованием кремниевых зондов PPP-CONTPt (Nanosensors, Швейцария). Жесткость мембран оценивалась по модулю Юнга, который рассчитывался согласно теории Герца [7]. В серии экспериментов сравнивались показатели жесткости мембраны нейтрофилов, полученных из крови здоровых доноров и больных ХОБЛ. Для этого проводили обзорное сканирование поля размером 60x60 мкм и выбирали для измерения не менее 15 клеток в каждом случае. Для визуализации сканируемых объектов использовалась программа PicoView 1.10, при дальнейшей обработке данных – программное обеспечение PicoImageBasic 5.1.Сила адгезии нейтрофилов определялась в режиме атомно-силовой спектроскопии. Использовались коллоидные V-образные зонды CP-PNPL-SiO-C с круглым наконечником (диаметр 6,62 мкм).

Статистическая обработка данных производилась в пакете прикладных программ StatisticaV.7.0 (StatsoftInc, США). Сравнение групп проводилось с помощью непараметрического теста Манна – Уитни, нулевая гипотеза об отсутствии различий групп отвергалась при p<0,05. Степень тесноты связи параметров оценивалась с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты исследования. При изучении картины периферической крови отмечалось увеличение количества циркулирующих нейтрофилов у больных ХОБЛ по сравнению с группой условно здоровых лиц (р<0,05). Статистически значимого различия количества циркулирующих нейтрофилов в зависимости от частоты обострений не наблюдалось (p>0,05).

С целью получения более полной информации о жесткости мембраны нейтрофилов больных ХОБЛ была проведена оценка модуля Юнга нативных нейтрофилов. Анализ результатов атомно-силовой спектроскопии упругих деформаций нейтрофилов позволил выявить, что клеточная мембрана нейтрофилов больных ХОБЛ по сравнению с контрольной группой характеризуется более высокими значениями модуля Юнга. Модуль Юнга нейтрофилов у больных ХОБЛ с редкими обострениями превышает этот показатель контрольной группы в 2,5 раза.

Результаты исследования показали, что жесткость мембраны нативных клеток контрольной группы составляет в среднем 15,29±0,05 кПа. У больных ХОБЛ с редкими обострениями этот показатель равен 35,15±0,28 кПа. У больных ХОБЛ с частыми обострениями жесткость мембраны нейтрофила составила в среднем 51,18±0,36 кПа, что в 3,3 раза выше, чем у контрольной группы лиц и (p<0,05) и в 1,45 раза выше, чем у больных ХОБЛ с редкими обострениями (p<0,05).

Результаты серий экспериментов по определению силы адгезии показали, что значение силы адгезии для нейтрофилов, выделенных у доноров контрольной группы, составляет 0,076± 0,0002 nH, тогда как в группе больных ХОБЛ с редкими обострениями этот показатель равен 0,33 ± 0,004nH. Максимальная величина адгезионного взаимодействия была зарегистрирована у нейтрофилов, выделенных из периферической крови больных ХОБЛ с частыми обострениями 0,49± 0,006nH.

Таким образом, методом прямых измерений с использованием АСМ нами определены адгезионные силы между поверхностью зонда и поверхностью нейтрофила. Показано, что сила адгезии нейтрофилов больных ХОБЛ с редкими обострениями выше, чем у нейтрофилов доноров контрольной группы в 4,34 раза. У больных ХОБЛ с частыми обострениями этот показатель выше контроля в 6,44 раза и группы больных ХОБЛ с редкими обострениями в 1,48 раза.

Изучение корреляционных взаимоотношений выявило обратную связь модуля Юнга и силы адгезии от показателей функции внешнего дыхания – ФЖЕЛ (r= -0,45, p<0,05 и r= -0,53, p<0,05), ООЛ (r= -0,38, p<0,05), прямую зависимость от частоты обострений (r= 0,72, p<0,05 и r=0,68, p<0,05 соответственно) (рис. 1,2).

Рис. 1. Корреляционная связь между частотой обострений и жесткостью мембраны нейтрофилов у больных ХОБЛ.

Рис. 2. Корреляционная связь между частотой обострений и силой адгезии мембраны нейтрофилов у больных ХОБЛ.

Обсуждение результатов. В нашей работе методом атомно-силовой микроскопии были изучены функциональные характеристики нейтрофилов у больных ХОБЛ с частыми обострениями. Нейтрофилы, секретируя сериновые протеазы (нейтрофильную эластазу, катепсин G и протеиназу-3), приводят к деструкции альвеолярной стенки ииграют одну из ведущих ролей в воспалении при ХОБЛ [1, 5]. Знание наномеханических (жесткость мембраны и сила адгезии) свойств нейтрофилов поможет лучше понять функции нейтрофилов в микроциркуляторном русле. Отвечая на инфекционные и воспалительные сигналы, нейтрофилы быстро достигают места инфекции и воспаления за счет микрососудистой, трансэндотелиальной и трансэпителиальной миграции. В ходе этого процесса нейтрофилы подвергаются динамической деформации и восстановлению. Увеличение деформации клеток (жесткости цитоплазматической мембраны) и площади контакта нейтрофилов с эндотелием способствует адгезии к эндотелию сосудов и ведет к его повреждению. В исследовании invitro, при их активации нейтрофилов, установлено повышение жесткости ихмембраны до 7 раз[14].

В нашем исследовании анализ результатов атомно-силовой спектроскопии показал увеличение жесткости мембран нейтрофилов у больных ХОБЛ. Установлено, что клеточная мембрана нейтрофилов больных ХОБЛ с частыми обострениями по сравнению с контрольной группой и группой больных с редкими обострениями характеризуется более высокой жесткостью, характеризуемой высокими значениями модуля Юнга и повышенной силой адгезии нейтрофилов. Выявлена зависимость исследуемых от показателей функции внешнего дыхания, характеризующих наличие эмфиземы легких и частоты обострений.

Таким образом, использование АСМ позволило установить значимое увеличение жесткости мембраны и силы адгезии нейтрофилов у больных ХОБЛ с частыми обострениями, которые могут быть использованы в качестве индикатора степени выраженности воспаления. Выявленные особенности вязко-упругих свойств нейтрофилов больных ХОБЛ имеют особое значение и вносят вклад в существующие представления о роли системного воспаления в развитии ХОБЛ.

Рецензенты:

Шамратова В.Г., д.б.н., профессор кафедры физиологии человека и зоологии, Башкирский государственный университет, г. Уфа;

Никуличева В.И., д.м.н., профессор кафедры терапии и общей практики с курсом гериатрии ИПО ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет МЗ РФ», г. Уфа.


Библиографическая ссылка

Гайнитдинова В.В., Шарафутдинова Л.А., Бакиров А.Б., Калимуллина Д.Х. КОНТАКТНАЯ АТОМНО-СИЛОВАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ С ЧАСТЫМИ ОБОСТРЕНИЯМИ // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=15996 (дата обращения: 21.08.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252