Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Короткова Н.В. 1 Фомина М.А. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет» им. И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Изучены активность лизосомальных цистеиновых протеиназ в плазме, полиморфноядерных и моноядерных лейкоцитах крови и факторы её регуляции у пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей и острым венозным тромбозом. Отмечено повышение активности катепсинов L и Н в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах, снижение в моноядерных лейкоцитах. Отмечена более высокая степень изменения активности катепсинов у пациентов с варикозным расширением вен. Концентрация цистатина С снижалась в плазме и клетках крови у пациентов с варикозом, повышалась в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах крови, снижалась в моноядерных лейкоцитах у пациентов с тромбозом. Изменение коэффициента аутокаталитической активации демонстрировало полную активацию изучаемых катепсинов в плазме и лейкоцитах крови пациентов с варикозом, неполную активацию – у пациентов с острым венозным тромбозом.

Статья в формате PDF

139 KB

лизосомальные цистеиновые протеиназы L и Н

полиморфноядерные лейкоциты

моноядерные лейкоциты

аутокаталитический процессинг

цистатин С

1.Богачёв В.Ю. Об участии лейкоцитов в патогенезе первичных форм хронических заболеваний вен нижних конечностей / В.Ю. Богачёв [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2011. – № 3. – С. 71 – 75.

2.Борискина М.А. Изменение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ у больных хроническими лейкозами в динамике заболевания. Дисс…канд. мед. наук. – Рязань. – 1996.

3. Barrett A.J. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L / A.J. Barrett., H. Kirschke // Methods in Enzymol. – 1981. –Vol. 80. – P. 535-561.

4.Barrett A.J., Rawlings N.D. ‘Species’ of peptidases. Biol Chem. 2007; 388(11):1151–1157.

5.Bouman A.C., Atalay, S., Ten Cate, H., Ten Wolde, M., Ten Cate-Hoek, A.J. Biomarkers for post-thrombotic syndrome (Review) // Journal of Vascular Surgery: Venous and Lymphatic Disorders Volume 2, Issue 1, January 2014, P. 79-88.

6. Bühler, A., Berger, S., Bengsch, F., Martin, G., Han, H., Vierkotten, S., Pielen, A., Boehringer, D., Schlunck, G., Fauser, S., Agostini, H.T., Reinheckel, T., Stahl, A. Cathepsin proteases promote angiogenic sprouting and laser-induced choroidal neovascularisation in mice // Experimental Eye Research Volume 115, October 2013, P. 73 – 78.

7. Ix J.H., Shlipak M.G., Chertow G.M., Whooley M.A. Association of Cystatin C With Mortality, Cardiovascular Events, and Incident Heart Failure Among Persons With Coronary Heart Disease: Data From the Heart and Soul Study // Circulation, 2007, vol. 115 №2,1 P. 73 – 179.

8. Lutgens S.P.M., Cleutjens K.B.J.M., Daemen M.J.A.P., Heeneman S. Cathepsin cysteine proteas-es in cardiovascular disease // The FASEB. J. 2007; 21: 3029 – 3041.

9. Mazzolai, L. Hereditary Trombophilia and Venous Thromboembolism: Critical Evaluation of the Clinical Implications of Screening [Text] / L. Mazzolai, M.A. Duchosal // Eur. J. Vasc. and Endovasc. Surgery. — 2007. — 34 (4). — P. 483-488.

10.McDaniel J.C., Roy S., Wilgus T.A. Neutrophil activity in chronic venous leg ulcers--a target for therapy? // Wound Repair Regen. 2013 May-Jun;21(3):339-51.

11.MEROPS-the Peptidil Database. URL: www.http: // merops.sanger.ac.uk.

12.Qin, Y., Shi, G.-P. Cysteinyl cathepsins and mast cell proteases in the pathogenesis and therapeutics of cardiovascular diseases // Pharmacology and Therapeutics Volume 131, Issue 3, September 2011, P. 338-350.

13.Qin Y., Cao X., Yang Y., Shi G.P. Cysteine protease cathepsins and matrix metalloproteinases in the development of abdominal aortic aneurysms //Future Cardiol. 2013 Jan;9 (1):89-103.

14.Turk V., Stoka V., Vasiljeva O., Miha Renko M., Sun T., Turk B., Turk D. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers // Biochimica et Biophysica Acta 1824, 2012; 68–88.

15. Xu N., Zhang, Y.-Y., Lin Y., Bao B., Zheng L., Shi G.-P., Liu J. Increased levels of lysosomal cysteinyl cathepsins in human varicose veins: A histology study // Thrombosis and Haemostasis, Volume 111, Issue 2, 24 October 2013, P. 333-344.

ЛЦП относят к клану СА семейства С1. Семейство C1 - папаиноподобные ферменты - проявляет свою протеолитическую активность в пищеварительных вакуолях простейших и лизосомальных системах эукариотических клеток. Наиболее изученными представителями являются катепсин В (C01.060), катепсин L (C01.032), катепсин S (C01.034), катепсин К (C01.036), катепсин H (C01.040) и дипептидил-пептидазы (C01.070) [11].

Первоначально считалось, что ЛЦП выполняют в клетке функции неспецифического протеолиза, но в течение последних двух с половиной десятилетий получено много данных об их участии в выполнении специфических функций при различных физиологических и патологических процессах [14].

В результате многочисленных исследований было установлено, что цистеиновые протеиназы принимают участие в развитии таких заболеваний, как аневризма абдоминальной аорты [13], рак и неоваскуляризация [6], сердечно-сосудистые заболевания [12]. Участие катепсинов в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний обусловлено их действием на элементы соединительной ткани. Так, катепсины В и в большей степени L могут повреждать коллаген II, IX и XI типов в кислых значениях рН, оказывать эластолитическое, коллагенолитическое и протеогликанолитическое действие [8].

На сегодняшний день распространёнными патологиями венозной системы человека являются варикозная болезнь нижних конечностей (ВБНК) и острый венозный тромбоз. Обе они представляют серьёзную проблему современного здравоохранения, так как в конечном итоге тромбоз может привести к формированию посттромбофлебитической болезни [5], обе патологии снижают трудоспособность и качество жизни пациентов, и зачастую приводят к инвалидизации и смертности.

Но данные об участии ЛЦП в патологии венозной системы остаются немногочисленными. В настоящее время появились работы, посвящённые участию лизосомальных ферментов нейтрофилов в появлении и прогрессировании трофических язв на фоне хронической венозной недостаточности [10]. Немаловажная роль отводится так называемым «активированным» лейкоцитам и макрофагам, которые могут явиться основным фактором повреждения венозной стенки и клапанов, а также паравазальных тканей при первичных формах хронических заболеваний вен нижних конечностей [1].

Поэтому актуальным остаётся дальнейшее изучение молекулярных механизмов патогенеза данных заболеваний.

Цель исследования - изучение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ - катепсинов L и Н в плазме и лейкоцитах крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей.

Материал и методы исследования

Объектом исследования явились 65 пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей, в том числе 40 пациентов с диагнозом «острый венозный тромбоз» и 25 пациентов с диагнозом «варикозное расширение вен нижних конечностей», находившихся на стационарном лечении в отделении сосудистой хирургии ГБУ РО «Областной клинический кардиологический диспансер» г. Рязани в 2011-2013 гг.

Средний возраст пациентов с острым венозным тромбозом и варикозным расширением вен нижних конечностей составил 62,5±11,7 и 47,6±13,7 года соответственно. Группу контроля составили клинически здоровые доноры отделения переливания крови ГУЗ «Рязанская областная клиническая больница), сопоставимые с испытуемыми по возрасту и полу.

Материалом для исследования явились плазма и лейкоциты периферической крови. Забор крови у пациентов производился утром в одно и то же время из локтевой вены натощак в количестве 15 мл. В качестве антикоагулянта использовали 0,5 М раствор ЭДТА.

Для выделения различных фракций лейкоцитов эритроциты осаждали 6 % раствором декстрана, после чего плазму со взвешенными в ней лейкоцитами подвергали изопикническому центрифугированию на градиенте плотности урографин - полиглюкин. При этом получали две фракции лейкоцитов: интерфазный слой содержал моноядерные лейкоциты (МЯЛ), представленные лимфоцитами и моноцитами, осадок - полиморфноядерные (ПМЯЛ) гранулоциты. Клетки отмывали 0,15 М раствором хлорида натрия, пропускали через капроновый фильтр, подсчитывали в камере Горяева и гомогенизировали пипетированием через иглу малого диаметра. Чистоту разделения лейкоцитов проверяли микроскопией окрашенных мазков из интерфазы и осадка (микроскоп бинокулярный Р-15 «Биолам»). Полученные описанным выше способом осадки отмытых лейкоцитов доводили до концентрации 10⁶ - 10⁷ клеток/мл дистиллированной водой, содержащей 0,1% раствор тритона Х - 100 и подвергали трёхкратному замораживанию - оттаиванию для окончательного разрушения плазматических и лизосомальных мембран. Гомогенизация производилась пипетированием через иглу малого диаметра. Нерастворимый материал осаждался центрифугированием (600 g, 10 минут). Супернатант использовался для определения активности ферментов.

Активность катепсинов L и Н изучали спектрофлуориметрическим методом по Barrett и Kirschke [3] с измерением флюоресцирующего продукта реакции - 7-амидо-4-метилкумарина, образующегося при расщеплении специфических флюорогенных субстратов. Результаты представляли в нмоль/чхл и в нмоль/10⁶ клеток.

Оценка аутоаталитической активации проводилась путём преинкубирования биологического материала в реакционной смеси, не содержащей субстрат, в течение 15 минут при 37ºС с последующим добавлением последнего [2]. Для сравнения степени аутокаталитической активации катепсинов подсчитывали коэффициент аутокаталитической активации (КАА): отношение значения активности ферментов после прекаталитической инкубации к значению активности, определённому без преинкубации.

Содержание цистатина С проводили с использованием наборов иммуноферментного анализа (ИФА) для определения цистатина С (ЦС) человека Bio Vendor (Чехия), содержащих специфичные для цистатина С человека антитела. Результаты представляли в нг/мл и нг/10⁶ клеток.

Для оценки статистической значимости межгрупповых различий использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении активности катепсинов L и Н в сыворотке и лейкоцитах крови у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей были выявлены следующие тенденции (табл.1).

Таблица 1

Показатели активности катепсинов L и Н в плазме (нмоль/чхл) и лейкоцитах (нмоль/чх10⁶ клеток) крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей, M±s

Активность катепсинов L и Н статистически значимо повышается в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах крови у пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей по сравнению с аналогичными показателями здоровых доноров. Активность же изучаемых ферментов в моноядерных лейкоцитах имеет противоположную тенденцию - статистически значимо снижается у пациентов с варикозом по сравнению с группой контроля.

У пациентов с острым венозным тромбозом активность исследуемых катепсинов статистически значимо повышается в плазме крови, статистически незначимо повышается в ПМЯЛ, а также снижается в МЯЛ (статистически значимо - активность катепсина Н, статистически незначимо - активность катепсина L).

Полученные данные позволяют предположить вовлечённость лизосомальных ферментов лейкоцитов в патологию вен нижних конечностей, что согласуется с данными литературы об участии лейкоцитов в данной патологии.

Из представленных данных видно, что изменение активности катепсинов L и Н у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей имеет однонаправленную тенденцию: повышается активность катепсинов L и Н в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах, снижается в моноядерных лейкоцитах. Степень изменения активности в плазме и лейкоцитах крови выше у пациентов с варикозным расширением вен.

При изучении содержания цистатина С в плазме и лейкоцитах крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей мы обнаружили следующее (табл. 2).

Таблица 2

Содержание цистатина С в плазме (нг/мл) и лейкоцитах крови (нг/10⁶) пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей, M±s

Концентрация цистатина С в плазме крови здоровых доноров оказалась сопоставима с данными литературы [7]. Из представленных данных видно, что концентрация эндогенного ингибитора ЛЦП цистатина С снижается в плазме, ПМЯЛ и МЯЛ крови пациентов с варикозным расширеним вен нижних конечностей. Причём снижение в МЯЛ является статистически значимым. Концентрация цистатина С повышается в плазме и ПМЯЛ крови, снижается в МЯЛ пациентов с острым венозным тромбозом. Необходимо отметить, что при более значительном повышении активности катепсинов (в 1,5-3 раза), что отмечалось в плазме и ПМЯЛ крови пациентов с варикозом, концентрация цистатина С снижалась. При незначительном повышении активности катепсинов (до 1,5 раз), что мы наблюдали в плазме и ПМЯЛ пациентов с острым венозным тромбозом, концентрация цистатина С повышалась, что позволяет подтвердить участие цистатина С как фактора регуляции активности изучаемых катепсинов при заболеваниях вен нижних конечностей. В моноядерных лейкоцитах крови как при варикозном расширении вен нижних конечностей, так и при остром венозном тромбозе отмечалась однонаправленная тенденция - снижение активности изучаемых катепсинов и концентрации их эндогенного ингибитора цистатина С.

Полученные данные согласуются с данными литературы о вовлечении лизосомального фермента L и его эндогенного ингибитора цистатина С в патогенез варикозной болезни нижних конечностей (ВБНК) [15].

При изучении аутокаталитического процессинга в плазме и лейкоцитах крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей были отмечены следующие тенденции (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительный анализ изменения коэффициента аутокаталитической активации в плазме и лейкоцитах крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей, M±s

У пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей катепсины L и Н находятся в активированном состоянии, степень аутокаталитической активации меньше как для катепсина L, так и для катепсина Н в плазме, ПМЯЛ, МЯЛ крови.

Острый венозный тромбоз сопровождается активацией незрелых форм катепсинов: катепсина L плазмы, ПМЯЛ, МЯЛ и катепсина Н плазмы и МЯЛ крови. Причём наибольшие изменения активности после аутокатализа отмечаются для катепсина Н в моноядерных лейкоцитах при тромбозе и для катепсина L в плазме при варикозе. Возможно, такие различия в аутокаталитическом процессинге связаны с хроническим течением при варикозе, что сопровождается полной активацией изучаемых ферментов.

Выводы

1. Изменение активности катепсинов L и Н у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей имеет однонаправленную тенденцию: повышается активность катепсинов L и Н в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах, снижается в моноядерных лейкоцитах. Степень изменения активности в плазме и лейкоцитах крови выше у пациентов с варикозным расширением вен.
2. Концентрация цистатина С снижается в плазме, полиморфноядерных и моноядерных лейкоцитах крови пациентов с варикозным расширением вен. Концентрация цистатина С повышается в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах крови и снижается в моноядерных лейкоцитах пациентов с острым венозным тромбозом.
3. Изменения КАА позволяют предположить, что при остром венозном тромбозе в плазме и лейкоцитах крови катепсины L и Н не полностью активированы, при варикозном расширении вен наблюдается их полная активация.

Демихов В.Г., д.м.н., профессор, директор Рязанского филиала ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачёва», г. Рязань;

Емельянова А.С., д.б.н., профессор кафедры технологии производства и переработки продукции животноводства, ФГБОУ ВПО «Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева», г. Рязань.

Библиографическая ссылка