Поиск эндогенных регуляторов гомеостаза является актуальной задачей современной фундаментальной медицинской науки. Ранее нами успешно продемонстрированы регуляторные эффекты церулоплазмина и альфа-1-кислого гликопротина при различной экспериментальной патологии [1-4]. В последние годы внимание многих зарубежных и отечественных исследователей привлекают плейотропные эффекты эритропоэтина (ЭПО). В 2007-2012 гг. нами исследовано влияние ЭПО у больных хронической почечной недостаточностью (ХПН) на аффективный, психофизиологический статус, систему гемостаза [3-10]. Полученные результаты позволили расширить имеющиеся представления о неэритропоэтических свойствах ЭПО в условиях дефицита его эндогенной продукции. Обнаружение рецепторов для ЭПО на различных субпопуляциях лимфоцитов, дендритных клетках, макрофагах является предпосылкой для изучения его иммунотропных эффектов. Цель работы - исследовать у больных с терминальной стадией ХПН, находящихся на заместительной гемодиализной терапии, наличие и характер связи между показателями иммунного статуса организма и содержанием ЭПО в сыворотке.
Материалы и методы исследования. Для реализации поставленной цели использована кровь больных людей с ХПН - пациентов отделения диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Первоначально обследовано 150 больных с терминальной стадией ХПН в возрасте от 21 до 60 лет, получающих гемодиализную терапию на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы Fresenius (Германия) 3 раза в неделю в течение 4 часов. Критерии исключения: 1) больные после трансплантации почки; 2) наличие на момент исследования гнойно-септических осложнений; 3) наличие у больных увеличенных лимфатических узлов любой локализации; 4) больные, принимающие глюкокортикостероидную и/или цитостатическую терапию; 5) злокачественные и доброкачественные опухоли любой локализации; 6) ВИЧ-инфекция, гепатит С, гепатит В; 7) аутоиммунные и/или аллергические заболевания. После рандомизации в исследование включено 37 больных, из них 17 женщин и 20 мужчин. От всех больных получено письменное информированное согласие. Группа 1 - контроль (n=12) представлена клинически здоровыми людьми - добровольцами, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами. Группа 2 - больные ХПН до процедуры гемодиализа (n=37). Группа 3 - больные ХПН после процедуры гемодиализа (n=37). Больные ХПН получали рекомбинантный человеческий ЭПО в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, Roche, Швейцария) и препарата «Эпокрин» (МНН: эпоэтин альфа, ЗАО «ФармФирма СОТЕКС», Россия) 2 раза в неделю внутривенно в дозе 2000-4000 МЕ в течение не менее 2 месяцев до начала исследования. ЭПО вводился в систему экстракорпорального контура в конце процедуры гемодиализа. Кровь для исследований у больных забиралась из артериального колена артериовенозной фистулы.
Количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу определяли общепринятыми методами. Функциональную активность фагоцитов периферической крови исследовали по показателям поглотительной способности частиц монодисперсного полистирольного латекса (активность, интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число), показателям кислородзависимого метаболизма в тесте с нитросиним тетразолием (активность и интенсивность спонтанного и индуцированного НСТ-теста), интенсивности люминесценции лизосом. Определение популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов крови проводили с помощью иммунофенотипирования методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител серии ICO производства НИИ «Препарат» (Н. Новгород). Проводили типирование зрелых Т-лимфоцитов (СD3+) и их субпопуляций: СD4+ - маркер клеток хелперно/индукторного ряда, СD8+ - маркер цитотоксических лимфоцитов, В-лимфоцитов (СD20+), NK-клеток (СD16+), маркер ранней активации лимфоцитов (CD25+). Определение уровня иммуноглобулинов Ig А, Ig M, Ig G в сыворотке проводили методом иммуноферментного анализа с тест-системами производства «Вектор-Бест» (Новосибирск) на фотометре Multiscan plus (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм и выражали в г/л. Уровень ЭПО в сыворотке до начала процедуры гемодиализа определяли на планшетном фотометре Multiscan plus (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм с применением тест-систем фирмы «Вектор-Бест» (Новосибирск), результат выражали в мМЕ/мл. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0. Для оценки различий между группами применяли критерии Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса, для установления связей между показателями - коэффициент корреляции Спирмена, различия считали значимыми при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. У больных ХПН в периферической крови при исследовании до процедуры гемодиализа наблюдаются эозинофилия и лимфоцитопения, содержание лимфоцитов снижено в среднем на 45% по сравнению с контрольной группой (табл. 1). После процедуры гемодиализа содержание лимфоцитов в крови повышается, но остается ниже значений у здоровых людей, кроме того, на правах тенденции увеличивается общее содержание лейкоцитов и нейтрофилов. Отмеченный факт увеличения лейкоцитов в крови является отражением гемоконцентрации, развивающейся в ходе процедуры гемодиализа.
При исследовании функциональной активности фагоцитов периферической крови установлена активация поглотительной способности: независимо от процедуры гемодиализа возрастает интенсивность фагоцитоза, т.е. способность клеток поглощать количество частиц латекса (в среднем на 25% при сравнении с контрольной группой). Кроме того, активируется кислородзависимый метаболизм фагоцитов, увеличивается активность и индекс спонтанного НСТ-теста, т.е. количество клеток, генерирующих АФК, и интенсивность генерации АФК отдельным фагоцитом (табл. 2). Процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на функцию фагоцитов в крови, что, с одной стороны, может свидетельствовать о высоком исходном (до диализа) уровне активности фагоцитов, с другой - являться одним из показателей биосовместимости мембраны диализатора, контакт с которой не приводит к дополнительной активации фагоцитов. Лизосомальная активность фагоцитов у больных ХПН как до, так и после диализной процедуры не имеет статистически значимых различий с группой здоровых людей.
Лимфоцитопения у больных ХПН находит отражение в количестве популяций и субпопуляций лимфоцитов (таблица 3). До процедуры гемодиализа значимо снижается содержание Т-лимфоцитов (CD3+) и их субпопуляций: Т-цитотоксических (CD4+) и Т-хэлперов (CD8+), В-лимфоцитов (CD20+), NK-клеток (CD16+). Кроме того, снижается количество лимфоцитов, несущих маркер ранней активации (CD25+). После процедуры гемодиализа фиксируется тенденция к увеличению популяций лимфоцитов, отражающая отмеченный выше феномен гемоконцентрации, а не истинное увеличение клеток в крови.
При анализе содержания иммуноглобулинов в плазме у больных ХПН обнаружено увеличение концентрации иммуноглобулинов классов M и G соответственно на 38% (2,37±0,15 г/л; 1,72±0,18 г/л; р<0,01) и 24% (14,56±0,64 г/л; 11,75±0,35 г/л; р<0,01), уровень иммуноглобулина А значимо не изменяется (3,61±0,26 г/л; 3,07±0,32г/л; р>0,05). Процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на уровень ЭПО в сыворотке. По-видимому, данный факт отражает компенсаторные возможности эффекторов гуморального адаптивного иммунитета в условиях депрессии клеточного звена или является следствием снижения клиренса антител из кровотока в условиях ХПН.
Зафиксированная нами активация фагоцитов у больных ХПН является многофакторной: имеют значение азотемия, нарушение обмена витамина D, гиперпаратиреоз и сопутствующее нарушение фосфорно-кальциевого обмена, нарушение обмена железа, анемия, активация РААС, гемодиализная процедура и др. факторы. Ключевую роль в патогенезе дисфункции иммунокомпетентных клеток при ХПН играют уремические токсины, которые могут оказывать про- и антиапоптогенное действие, усиливать или подавлять функциональную активность клеток, изменять их пролиферативный потенциал. Активация фагоцитов и связанная с этим гиперергия воспалительного процесса на местном уровне, системный воспалительный ответ рассматриваются как факторы прогрессирования ХПН, поражения сердечно-сосудистой системы, подавления специфического иммунного ответа и, как следствие, развития circulus vitiosus инфекционной патологии. В связи с этим воспаление при ХПН презентируется, с одной стороны, как главная движущая сила «уремического фенотипа», с другой - как мишень терапевтических мероприятий.
По данным других исследователей, ранняя активация Т-лимфоцитов у больных ХПН коррелирует с высоким уровнем апоптоза, что приводит к Т-лимфоцитопении и прогрессированию иммунодефицитного состояния, усугубляемого процедурой гемодиализа. Полагают, что апоптоз Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитопения при ХПН могут быть обусловлены влиянием уремических токсинов, избытка свободного железа, окислительного стресса, гиперфосфатемии в условиях вторичного гиперпаратиреоза и др. факторами (20).
Исследование уровня ЭПО в сыворотке у больных ХПН до процедуры диализа показало статистически значимое снижение по сравнению с группой здоровых людей (10,83±0,56 мМЕ/мл; в контрольной группе 19,16±0,86 мМЕ/мл; р<0,001). Период полувыведения ЭПО после внутривенного введения составляет в среднем 5-6 ч. Клиренс ЭПО до конца изучен, полагают, что элиминация ЭПО осуществляется преимущественно через почки с мочой, частично печенью, а также путем захвата клетками-мишенями в костном мозге и других тканях. В связи с тем что у больных с терминальной стадией ХПН экскреция ЭПО через почки невозможна, уровень ЭПО в междиализный период (около 50 ч) может быть выше ожидаемого с учетом кинетики ЭПО в организме.
Нами установлена связь между некоторыми показателями иммунного статуса и концентрацией ЭПО в сыворотке у больных ХПН (таблица 4). Как видно, содержание лимфоцитов, в том числе CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, снижается по мере уменьшения концентрации ЭПО в сыворотке. Полагаем, что обнаруженный факт может быть связан с антиапоптогенным эффектом ЭПО в отношении лимфоцитов. В Т- и В-лимфоцитах наблюдаются экспрессия гена EPOR и мРНК EPOR, при этом у больных ХПН при активации лимфоцитов экспрессия гена EPOR и количество EPOR на лимфоцитах возрастает.
Доза ЭПО, применяемая у больных ХПН, достаточна для стимуляции эритроидного ростка кроветворения и поддержания необходимого уровня эритроцитов и гемоглобина в условиях дефицита его эндогенной продукции согласно рекомендациям рабочей группы National Kidney Foundation - Dialysis Outcomes Quality Initiative: содержание эритроцитов 3,23∙1012/л±0,08∙1012/л; гемоглобина 101,29±3,39 г/л. Кроме того, полная коррекция анемии у диализных больных нецелесообразна из-за увеличения количества осложнений.
Для проявления неэритропоэтических эффектов ЭПО необходима большая концентрация гормона в крови и соответственно более высокая разовая и суммарная доза вводимого экзогенного рчЭПО. Так, эффект ЭПО в клетках эритроидного ряда проявляется в пикомолярных концентрациях. Структура EPOR на неэритроидных клетках (TPR) отличается от EPOR на клетках-предшественницах эритроцитов, а для его активации требуются наномолярные концентрации EPO, что снижает вероятность перекрестных эффектов EPO на эндокринном и паракринном уровнях. В связи с неэритропоэтическими эффектами система ЭПО-EPOR на ауто- и паракринном уровне рассматривается как звено неспецифической защиты при повреждении, а EPOR на неэритроидных клетках обозначается как защищающие ткань рецепторы (TPR).
Для объяснения полученных результатов требуется проведение дополнительных исследований иммунотропных эффектов ЭПО, в частности влияния на апоптоз иммунокомпетентных клеток, экспрессию антигенов межклеточной кооперации, продукцию цитокинов, экспрессию цитокиновых рецепторов и др. механизмы.
Таблица 1
Количественный состав лейкоцитов в периферической крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе (M±m)
|
Группы / показатели |
Группа 1, контроль (n=12) |
Группа 2, ХПН до диализа (n=37) |
Группа 3, ХПН после диализа (n=37) |
|
Лейкоциты, • 109/л |
6,05±0,27 |
5,41±0,03 |
6,21±0,38 |
|
Эозинофилы, • 109/л |
0,09±0,01 |
0,17±0,03 * |
0,16±0,03 |
|
Нейтрофилы п/яд., • 109/л |
0,16±0,04 |
0,08±0,01 |
0,10±0,02 |
|
Нейтрофилы с/яд., • 109/л |
4,01±0,19 |
4,02±0,26 |
4,45±0,29 |
|
Нейтрофилы всего, • 109/л |
4,17±0,21 |
4,10±0,26 |
5,04±0,53 |
|
Лимфоциты, • 109/л |
1,29±0,05 |
0,71±0,06 * |
1,01±0,10 * # |
|
Моноциты, • 109/л |
0,49±0,04 |
0,43±0,04 |
0,49±0,04 |
Примечание. Здесь и далее * - значимые (р<0,05) различия с группой 1, # - группой 2.
Таблица 2
Функциональная активность фагоцитов периферической крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе (M±m)
|
Группы / показатели |
Группа 1, контроль (n=12) |
Группа 2, ХПН до диализа (n=37) |
Группа 3, ХПН после диализа (n=37) |
|
Активность фагоцитоза, % |
49,33±2,14 |
47,48±2,54 |
46,22±2,11 |
|
Инт-ть фагоцитоза, у.е. |
1,22±0,08 |
1,51±0,07 * |
1,53±0,09 * |
|
Фагоцитарное число, у.е. |
2,69±0,17 |
2,50±0,12 |
2,47±0,13 |
|
НСТ-тест спонт., акт-ть, % |
19,83±2,17 |
28,68±2,02 * |
28,54±1,99 * |
|
НСТ-тест спонт., индекс |
0,37±0,05 |
0,49±0,04 * |
0,47±0,04 * |
|
НСТ-тест инд., акт-ть, % |
27,67±2,73 |
33,97±3,25 |
28,27±1,41 |
|
НСТ-тест инд., индекс |
0,47±0,05 |
0,48±0,04 |
0,47±0,03 |
|
Лизосомальная акт-ть, у.е. |
291,17±13,31 |
298,97±12,77 |
302,79±13,91 |
Таблица 3
Популяционный спектр лимфоцитов периферической крови у больных ХПН (М±m)
|
Группы / показатели |
Группа 1, контроль (n=12) |
Группа 2, ХПН до диализа (n=37) |
Группа 3, ХПН после диализа (n=37) |
|
CD3+, • 109/л |
0,77±0,04 |
0,39±0,05 * |
0,55±0,07 * |
|
CD4+, • 109/л |
0,57±0,04 |
0,28±0,03 * |
0,38±0,05 * |
|
CD8+, • 109/л |
0,47±0,04 |
0,21±0,02 * |
0,29±0,03 * |
|
CD16+, • 109/л |
0,27±0,03 |
0,12±0,02 * |
0,17±0,02 * |
|
CD20+, • 109/л |
0,26±0,02 |
0,12±0,02 * |
0,16±0,02 * |
|
CD25+, • 109/л |
0,18±0,02 |
0,09±0,01 * |
0,14±0,02 * |
Таблица 4
Корреляция между показателями иммунного статуса и концентрацией ЭПО в плазме у больных ХПН
|
Показатели иммунного статуса |
Эритропоэтин, мЕД/мл |
|
Лейкоциты, • 109/л |
R= 0,07; р>0,05 |
|
Эозинофилы, • 109/л |
R= - 0,02; р>0,05 |
|
Нейтрофилы палочкоядерные, • 109/л |
R= 0,09; р>0,05 |
|
Нейтрофилы сегментоядерные, • 109/л |
R= 0,07; р>0,05 |
|
Нейтрофилы всего, • 109/л |
R= 0,04; р>0,05 |
|
Лимфоциты, • 109/л |
R= 0,37; р<0,05 |
|
Моноциты, • 109/л |
R= 0,01; р>0,05 |
|
Активность фагоцитоза, % |
R= 0,01; р>0,05 |
|
Интенсивность фагоцитоза, у.е. |
R= - 0,11; р>0,05 |
|
Фагоцитарное число, у.е. |
R= - 0,07; р>0,05 |
|
НСТ-тест спонтанный, активность, % |
R= - 0,17; р>0,05 |
|
НСТ-тест спонтанный, индекс, у.е. |
R= - 0,13; р>0,05 |
|
НСТ-тест индуцированный, активность, % |
R= - 0,09; р>0,05 |
|
НСТ-тест индуцированный, индекс, у.е. |
R= - 0,12; р>0,05 |
|
Лизосомальная активность, у.е. |
R= - 0,01; р>0,05 |
|
CD3+, • 109/л |
R= - 0,27; р>0,05 |
|
CD4+, • 109/л |
R= - 0,32; р<0,05 |
|
CD8+, • 109/л |
R= - 0,34; р<0,05 |
|
CD16+, • 109/л |
R= - 0,54; р<0,05 |
|
CD20+, • 109/л |
R= - 0,32; р<0,05 |
|
CD25+, • 109/л |
R= - 0,16; р>0,05 |
|
Ig A, г/л |
R= 0,13; р>0,05 |
|
Ig M, г/л |
R= - 0,11; р>0,05 |
|
Ig G, г/л |
R= - 0,06; р>0,05 |
Примечание. R - коэффициент корреляции Спирмена, р - уровень значимости связи.
Выводы
1. У больных ХПН, находящихся на заместительной гемодиализной терапии, наблюдаются неоднозначные изменения иммунного статуса: активация эффекторов врожденного иммунитета, презентируемая увеличением поглотительной активности и кислородзависимого метаболизма, снижение количества в периферической крови Т-лимфоцитов и их субпопуляций, В-лимфоцитов, NK-клеток, активированных лимфоцитов и увеличение уровня иммуноглобулинов классов М и G.
2. В междиализный период концентрация ЭПО в сыворотке у больных ХПН снижается, но остается на уровне, достаточном для коррекции гемической гипоксии повышением уровня эритроцитов и гемоглобина в крови.
3. Установлено, что снижение количества популяций и субпопуляций лимфоцитов в крови у больных ХПН нарастает по мере снижения концентрации ЭПО в сыворотке.
Рецензенты:
Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г.Челябинск.
Волчегорский И.А., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г.Челябинск.