Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

ANTIVIRAL PROPERTIES OF AQUEOUS EXTRACTS ISOLATED FROM HIGHER BASIDIOMYCETES AS RESPECT TO PANDEMIC INFLUENZA VIRUS А(H1N1)2009

Filippova E.I. 1 Mazurkova N.A. 1 Kabanov A.S. 1 Teplyakova T.V. 1 Ibragimova Zh.B. 1 Makarevich E.V. 1 Mazurkov O.Yu. 1 Shishkina L.N. 1
1 State Research Center of Virology and Biotechnology Vector
Проведено исследование токсичности и противовирусной активности водных экстрактов высших базидиальных грибов Laetiporus sulphureus (трутовик серно-желтый), Ganoderma applanatum (трутовик плоский) и Inonotus obliquus (трутовик скошенный, чага) на перевиваемой линии клеток MDCK и мышах Balb/c. Выявлено, что все исследованные грибные экстракты малотоксичны для культуры клеток MDCK и лабораторных животных. Установлено, что экстракты базидиомицетов подавляют размножение пандемического вируса гриппа А/Moscow/226/2009 (H1N1)v в культуре клеток MDCK на 2,69 – 3,22 lg, что было сравнимо с эффектом референс-препарата Тамифлю® в этих экспериментах (подавление репродукции вируса составило 2,90 lg). В опытах in vivo при пероральном введении экстрактов базидиомицетов мышам, инфицированным штаммом пандемического вируса гриппа А/Moscow/226/2009 (H1N1)v, наблюдается уменьшение его продукции в легких животных. Через 4 сут после инфицирования мышей вирусом гриппа его концентрация в гомогенатах легких у животных, получавших экстракты базидиомицетов Inonotus obliquus и Laetiporus sulphureus, была достоверно ниже контроля на 1,83 и 2,00 lg соответственно; для мышей, получавших Тамифлю®, снижение содержания вируса по сравнению с контролем составило 2,16 lg.
Aqueous extracts of higher fungi basidiomycetes Laetiporus sulphureus, Ganoderma applanatum и Inonotus obliquus were investigated with respect to their toxicity and antiviral activity for cell culture MDCK and mice Balb/c. All investigated specimens fungal extracts were low-toxic for cell culture MDCK and laboratory animals. Fungal extracts reduced the infectivity of pandemic influenza virus strain А/Moscow/226/2009 (H1N1)v in MDCK cells about 2,69 – 3,22 lg, that was comparable with the use of Tamiflu® (the suppression of reproduction of the virus was 2,90 lg). In experiments in vivo by per oral administration of basidiomycetes extracts to mice infected with the pandemic influenza virus strain А/Moscow/226/2009 (H1N1)v there is a reduction of its products in the lungs of animals. 4 days post infection the virus concentration in lung homogenates of animals treated with basidiomycetes Inonotus obliquus и Laetiporus sulphureus extracts was authentically lower than control on 1,83 and 2,00 lg respectively; for mice treated with Tamiflu® the reduction of the virus concentration in comparison with the control was 2,16 lg.
antiviral activity
toxicity
influenza B
influenza A
Balb/c mice
cell culture MDCK
pandemic influenza virus
aqueous extracts
basidiomycetes

Введение

Вирус гриппа является единственным вирусом, способным вызвать пандемию в современном мире. В прошлом столетии зарегистрированы три пандемии, различающиеся по своей тяжести. Наиболее разрушительной была пандемия «испанского гриппа» в 1918-1919 гг., по разным данным, приведшая к заражению 600 млн и гибели 50-100 млн человек (т.е. 30 % и 5 % населения земного шара соответственно) и вызванная вирусом гриппа А антигенного субтипа H1N1 (прототипный штамм A/Brevig Mission/1/18). Следующие пандемии гриппа, имевшие место в 1957-1959 гг. («азиатский грипп»), вызванный вирусом гриппа H2N2 (прототип - A/Singapore/1/57), и в 1968-1970 гг. («гонконгский грипп»), вызванный вирусом гриппа H3N2 (прототип - A/Hong Kong/1/68), стали причиной гибели около 2 млн и 500 тыс. человек соответственно. По официальным данным, «азиатским гриппом» переболело от 20 до 50 % населения Земли, а заболеваемость «гонконгским гриппом» составляла около 20 %.

Первая в новом веке пандемия «свиного гриппа» (2009-2010 гг.; A/California/07/09 (H1N1) swl), на конец марта 2010 г., по данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), стала причиной гибели более 17 тыс. человек, потребовала масштабных затрат и усилий международного сообщества на проведение противоэпидемических мероприятий [8]. Пандемический вирус гриппа 2009 года отличается от обычного сезонного гриппа H1N1, циркулирующего в человеческой популяции с 1977 года, уникальной комбинацией генов, имеющих происхождение от вирусов гриппа птиц, свиней и человека. Заболевание, вызываемое этим вирусом, более контагиозное по сравнению с сезонным гриппом и быстро передается от человека к человеку.

Борьба с гриппозной инфекцией основывается на вакцинопрофилактике и на лечении с применением иммунокоррегирующей, патогенетической, симптоматической терапии, вирулицидных и противовирусных этиотропных препаратов. Однако для лечения и профилактики пандемического гриппа ВОЗ рекомендует использовать препараты этиотропного действия, оказывающие непосредственное прямое воздействие на размножение вируса.

В настоящее время в мире активно проводятся исследования по поиску и разработке противовирусных препаратов на основе соединений природного происхождения, обладающих более мягким терапевтическим действием и низкой токсичностью по сравнению с синтетическими лекарственными средствами. В этом отношении базидиальные грибы представляют значительный интерес как источники лечебных и профилактических средств с противоопухолевой, иммуностимулирующей и противовирусной активностью. Так, Pirano F. получил на основе водного экстракта гриба Rozites caperata антивирусный препарат белковой природы, препятствующий процессу репликации вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, цитомегаловирусов, респираторного синциального вируса и вируса гриппа типа А [12]. Mothana R. A. A. с соавт. [11] обнаружил противовирусную активность экстрактов Ganoderma pfeifferi против вируса гриппа типа А и вируса простого герпеса 1 типа, при этом основными антивирусными компонентами были тритерпеноиды: ганодермадиол, луцидодиол и апланоксиновая кислота G. В работе Ali N.A.A. et al. [9] показано, что вещества хиспидин и хисполон, имеющие изопреноидную природу и найденные в этанольном экстракте гриба Inonotus hispidus, проявляли активность против вируса гриппа типа А и типа В. Исследования, проведенные нами, показали перспективность поиска продуцентов антивирусных соединений среди базидиальных грибов в отношении вируса гриппа А субтипов H3N2 и H5N1 [6, 7].

Целью данной работы является изучение противовирусной активности водных экстрактов, выделенных из базидиомицетов, на перевиваемой культуре клеток MDCK и мышах Balb/c в отношении пандемического вируса гриппа А(H1N1)2009.

Материалы и методы

Экстракты базидиальных грибов. В работе были использованы водные экстракты из плодовых тел базидиальных грибов Ganoderma applanatum (09-11), Laetiporus sulphureus (09-12) и склероция Inonotus obliquus (09-24). Концентрации сухого вещества в исследуемых образцах 09-11, 09-11 и 09-24 были следующими: 13,3; 5,0 и 27,5 мг/мл соответственно.

Культура клеток. Для тестирования токсичности и противовирусной эффективности грибных экстрактов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Суспензию клеток с концентрацией 1×105 кл./мл питательной среды Stem Alpha.MDCK (Франция) вносили в объеме 100 мкл/лунку 96-луночного планшета. Планшеты с клетками помещали в термостат на 2-3 сут до образования монослоя при температуре 37 ºC, 5 % СО2 и 100 % влажности.

При определении токсических доз экстракты разводили в 5, 10, 102, 103, 104, 105, 106 раз средой Stem Alpha.MDCK, вносили по 50 мкл/лунку экстрактов и 100 мкл/лунку среды, планшеты ставили в термостат на 2 сут при температуре 37 ºC, 5 % СО2 и 100 % влажности. Через 2 сут с помощью инвертированного микроскопа оценивали деструктивные изменения в монослое клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями экстрактов. В качестве контроля использовали монослой культуры клеток MDCK без экстракта. Определяли минимально токсическую концентрацию (МТК) и максимально переносимую концентрацию (МПК), равную половине концентрации экстракта, не оказывающей на клетки токсического действия. В исследованиях противовирусной активности экстрактов грибов использовали МПК или более низкие концентрации [5].

Вирус гриппа (ВГ). В работе использовали штамм пандемического вируса гриппа А/Moscow/226/2009 (H1N1)v, полученный из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Концентрацию вируса определяли путем титрования на клетках MDCK [3], рассчитывали и выражали в lg ТЦД50/мл (десятичных логарифмах 50 %-х тканевых цитопатических доз в мл) по методу Спирмана - Кербера [2].

Препарат сравнения. В качестве референс-препарата использовали Тамифлю® (Ф.Хоффманн - Ля Рош Лтд., Швейцария). В экспериментах in vitro Тамифлю вносили в культуральную среду в конечной концентрации 100 мкг/мл через 1 ч после адсорбции вируса на клетках MDCK. В экспериментах in vivo Тамифлю® вводили мышам один раз в сутки перорально из расчета 30 мкг/г массы в объеме 0,2 мл сразу после заражения и далее в течение 4 сут после заражения вирусом гриппа.

Лабораторные животные. В работе были использованы мыши Balb/c массой 14-16 г, полученные из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Мышей содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды, подвергали эвтаназии в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях [4].

Определение противовирусной активности экстрактов на культуре клеток. Для определения противовирусной активности грибных экстрактов in vitro применяли максимально переносимые концентрации (МПК) препаратов. В среде Stem Alpha.MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина, готовили 8 разведений ВАЖ с десятикратным шагом. На монослой клеток MDCK вносили разведения экстракта в объеме 50 мкл/лунку и разведения вируссодержащей жидкости (ВСЖ) (с 1-го по 8-е) в объеме 100 мкл/лунку. Клетки инкубировали 3 сут при температуре 37 ºC в атмосфере 5 % СО2 в термостате. Затем в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали цитопатическое действие в монослое клеток и определяли наличие вируса гриппа в среде культивирования по реакции гемагглютинации с 1 % эритроцитами кур. Определяли инфекционность вируса в клетках, то есть титры вируса гриппа в lg ТЦД50/мл в опыте и контроле (ИД50 in vitro с экстрактом и без него), а затем высчитывали индекс его нейтрализации (ИН) под влиянием экстракта: ИН = ИД50контроль - ИД50опыт (lg) [5].

Изучение противогриппозного действия экстрактов на лабораторных мышах. Мышей инфицировали интраназально под легким эфирным наркозом при введении в обе ноздри суммарно 40 мкл соответствующего разведения штамма вируса гриппа А/Moscow/226/2009 (H1N1)v в дозе 10 ИД50 (50 %-х инфицирующих доз in vivo), равной 1,3±0,3 lg ЭИД50/гол. (десятичных логарифмов 50 %-й эмбриональной инфицирующей дозы), применение которой приводило к инфицированию 100 % животных (ИД100). Мышам перорально вводили экстракты базидиальных грибов родов Laetiporus и Inonotus в объеме 200 мкл/гол. сразу после заражения вирусом гриппа и далее один раз в день в течение 4 сут. Дозу вводимых экстрактов определили опытным путем в предварительных экспериментах. Определение концентрации ВГ в легких животных проводили через 4 сут. после заражения вирусом гриппа при титровании объединенных гомогенатов легких для мышей каждой группы на культуре клеток MDCK, рассчитывали по методу Спирмана - Кербера и выражали в lg ТЦД50/мл [2].

Статистическая обработка данных. При расчетах 50 %-х инфицирующих доз и титров вируса гриппа в биологических образцах в каждом единичном повторе использовали метод Спирмана - Кербера: определяли 95 %-й доверительный интервал (I95) и сравнивали по z-критерию [2]. Для нескольких повторов определяли среднее значение показателя (M) и ошибку среднего (m), достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента [2].

Результаты и обсуждение

Первичный скрининг противовирусной активности водных экстрактов базидиальных грибов в отношении пандемического вируса гриппа А/Moscow/226/2009 (H1N1)v нами был проведен на культуре клеток MDCK. Было показано, что все исследованные экстракты подавляют репликацию пандемического вируса гриппа (H1N1)v (таблица). Представленные в таблице данные свидетельствуют о достоверном снижении инфекционности вируса гриппа в культуре клеток MDCK при инкубировании с экстрактами на (2,69 - 3,22) lg относительно контроля. Инфекционность вируса гриппа в клетках MDCK при использовании Тамифлю® также была ниже, чем в контроле на 2,90 lg.

Далее по результатам экспериментов в культуре клеток MDCK нами были отобраны наиболее эффективные экстракты для определения способности подавлять продукцию штамма вируса гриппа А/Moscow/226/2009 (H1N1)v в легких у лабораторных мышей через 4 сут после заражения (таблица). Как видно из таблицы, через 4 сут после инфекции концентрация вируса гриппа в гомогенатах легких у мышей, получавших препараты 09-12, 09-24 и Тамифлю®, была достоверно ниже контроля на 2,00; 1,83 и 2,16 lg соответственно.

Таблица

Противовирусная активность водных экстрактов базидиомицетов в отношении пандемического вируса гриппа А/Moscow/226/2009 (H1N1)v in vitro и in vivo

Препараты

Концентрация

препаратов in vitro

(мг/мл)

Суточная доза

препаратов in vivo

(мкг/г массы мыши)

Инфекционность вируса в клетках MDCK (ИД50 в lg ТЦД50/мл) через 3 сут после заражения при инкубировании

с препаратами

(M±m, n=6)

Титры вируса (в lg ТЦД50/мл ±I95) в гомогенатах легких у мышей, через 4 сут после заражения при пероральном введении препаратов

09-11 (Ganoderma

Applanatum)

4,4

180,0

2,65±0,08*

н/и

09-12 (Laetiporus

Sulphureus)

1,7

66,7

2,23±0,08*

1,83±0,21*

09-24 (Inonotus

Obliquus)

9,2

366,7

2,76±0,08*

2,00±0,22*

Тамифлю

0,1

30,0

2,55±0,09*

1,67±0,17*

Контроль

(без препарата)

 

 

5,45±0,08

3,83±0,21

Примечание: * - достоверное отличие от соответствующего контроля (p≤0,05);

n - число повторов; н/и - не исследовали.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что исследованные водные экстракты базидиальных грибов Ganoderma applanatum, Inonotus obliquus, Laetiporus sulphureus подавляют репликацию пандемического вируса гриппа А/Moscow/226/2009 (H1N1)v в культуре клеток MDCK. Кроме того, при пероральном введении экстрактов базидиальных грибов Laetiporus sulphureus и Inonotus obliquus мышам, инфицированным этим штаммом, наблюдается уменьшение его продукции в легких.

Одной из возможных причин эффективности проверяемых экстрактов, выделенных из базидиальных грибов, является наличие в них полисахаридов, меланинов, флавоноидов и других биологически активных веществ [1, 10, 12, 13].

Заключение

Обнаружение противовирусной активности экстрактов базидиальных грибов открывает перспективу для дальнейших исследований по созданию на их основе препаратов, обладающих профилактическим и лечебным эффектом в отношении вируса гриппа, в том числе пандемического вируса гриппа А(H1N1)2009.

Рецензенты:

Трошкова Галина Павловна, д-р биол. наук, профессор, заведующая сектором биохимии отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область.

Белявская Валентина Александровна, д-р биол. наук, заведующая сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций, профессор ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская область.