Наночастицы коллоидного золота с плазмонным резонансом нашли разнообразные применения в нанобиотехнологии и наномедицине благодаря возможности варьировать спектральное положение и амплитуду плазмонного резонанса за счет изменения размера, формы, структуры частиц. Результаты ряда исследований, проведенных в последние годы, свидетельствуют об особенностях биологического действия наноматериалов, отличающих их от традиционных соединений [7, 9]. Это открывает широкие возможности использования наноматериалов в медицине, фармакологии, производстве продуктов питания, при решении экологических и сельскохозяйственных задач. Однако высокая биологическая активность техногенных наночастиц несет в себе потенциальные риски токсических эффектов для работников нанотехнологических предприятий, потребителей продукции наноиндустрии, контактирующих с нанотехнологическими производствами и их отходами [2, 4].
Наночастицы поступают в организм, как правило, в виде агрегатов/ассоциатов и(или) с поверхностью, модифицированной в результате взаимодействия с биологическим окружением. Поверхностная модификация многих наночастиц белками (адсорбционное формирование «белковой короны») и другими полимерами биологического матрикса in vitro и in vivo показана во многих работах [1, 3, 5]. Наличие «белковой короны» может в значительной степени влиять на биосовместимость и биораспределение техногенных наночастиц [1], в том числе на их распознавание клетками иммунной системы.
Измерение степени поверхностной модификации наночастиц представляет существенную проблему. Целью настоящей работы являлась разработка подхода на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ) для анализа поверхностной модификации наночастиц коллоидного золота.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
При определении поверхностных свойств наночастиц коллоидного золота и их конъюгатов аликвоту раствора наночастиц, синтезированых по методике [6], или их конъюгатов (5-10 мкл), синтезированных согласно [8], наносили на поверхность подложки (свежесколотая слюда), инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин, удаляли избыток жидкости фильтровальной бумагой и высушивали при комнатной температуре в эксикаторе с хлористым кальцием.
Сканирование образцов проводили в контактном режиме с использованием кантилеверов fpС10S («Нанотюнинг», Россия), радиус кривизны ≤10 нм, с жесткостью <0.2 Н/м. Образцы последовательно сканировали на участках площади 35х35 мкм2, 10х10 мкм2, 5х5 мкм2 и 1х1 мкм2. Далее переключали микроскоп в режим спектроскопии и снимали силовые кривые с выбранных объектов в координатах силы (F, Н - ось ординат) и расстояния зонд-поверхность (z, м - ось абсцисс). Силовую кривую для каждого объекта получали в пяти повторах.
Измерения проводились с использованием атомно-силового микроскопа «SmartSPM» («Аист-НТ», Россия). Первоначальное изображение подвергали математической обработке в программе «Gwiddion» (Czech Metrology Institute, Чехия) для устранения искажений: нелинейность сканирования, температурный дрейф и др.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получаемые методом АСМ изображения немодифицированных наночастиц и наночастиц, покрытых белковыми молекулами или подвергшихся иным преобразованиям, невозможно достоверно отличить при использовании только режима сканирования. На рис. 1, А, Б представлены изображения наночастиц коллоидного золота и их конъюгатов с иммуноглобулинами класса G соответственно. Как видим, морфологические особенности не являются признаком, существенным для определения степени модификации исходных наночастиц.
А Б
Рис. 1. Изображения наночастиц коллоидного золота (А) и конъюгатов наночастиц коллоидного золота с иммуноглобулинами класса G (Б), полученные методом атомно-силовой микроскопии
Предлагаемый анализ степени поверхностной модификации наночастиц коллоидного золота проводится по измерению параметра жесткости (модуля упругости, модуля Юнга) и сил взаимодействия зонда с модифицированной или немодифицированной поверхностью наночастицы. Атомно-силовая спектроскопия позволяет проводить измерение модуля упругости, основанное на определении степени деформации поверхности при ее взаимодействии с вершиной зонда атомно-силового микроскопа. Метод заключается в регистрации силовых кривых, которые отражают отклонение гибкой балки АСМ-зонда при взаимодействии с поверхностью в зависимости от расстояния между ними. Для расчета абсолютного значения модуля Юнга по силовым кривым в методике используется модель Герца, в которой рассматривается взаимодействие жесткой полусферы (АСМ-зонд) и бесконечной плоскости (поверхность наночастицы или модифицированной наночастицы).
Для получения достоверных отличий между немодифицированными и модифицированными наночастицами коллоидного золота рассмотрим более подробно измерения в режиме атомно-силовой спектроскопии, при которых кантилевер движется в вертикальном направлении. Согласно закону Гука (F = kd, где F соответствует силе отрыва, k - константе жесткости кантилевера, d - отклонению кантилевера) сила отрыва прямо пропорциональна отклонению кантилевера.
При измерении модуля упругости наночастиц по силовой кривой определяют реальное расстояние между зондом и образцом (δ) по закону Гука:
(1),
где F - сила взаимодействия кантилевера и образца, k - жесткость кантилевера, d - отклонение кантилевера, z - перемещение пьезосканера по вертикали, δ - деформация образца в приближении недеформированного зонда (реальное расстояние между иглой и образцом).
Модуль упругости определяли по модели Герца, используя следующую формулу:
(2),
где E - модуль упругости, ν - коэффициент Пуассона, R - радиус иглы.
Таким образом
(3),
где А - коэффициент пропорциональности.
Построив график зависимости логарифма силы от логарифма отклонения, получали прямую вида Y = kX + B, где k ≈ 1,5, B = lnA. По формуле (2) находили значения локального модуля упругости.
Рис. 2. Зависимость силы по координате Z от расстояния зонд-поверхность при подводе кантилевера к поверхности слюды и немодифицированных наночастиц коллоидного золота (черные кривые), конъюгатов наночастиц коллоидного золота с иммуноглобулинами класса G (красные кривые)
Силы взаимодействия оценивают, исходя из силовых кривых - зависимостей отклонения иглы от перемещения кантилевера в вертикальном направлении (рис. 2). Благодаря программным методам обработки сигнала силовая кривая может быть преобразована в зависимость силы отрыва от перемещения в вертикальном направлении. Следует отметить появление значимого локального минимума на силовой кривой модифицированных наночастиц коллоидного золота. Для измерения сил взаимодействия проводят построение вертикальной проекции по оси ординат (см. величину F на рис. 2), соответствующей отрезку от локального минимума на силовой кривой отвода до горизонтального отрезка на кривой подвода. Эта вертикальная проекция отражает значение сил взаимодействия зонда с модифицированной поверхностью наночастицы. Степень поверхностной модификации наночастиц определяется как отношение силы взаимодействия зонда с немодифицированной поверхностью наночастицы к силе взаимодействия зонда с модифицированной поверхностью или отношение модуля упругости немодифицированных наночастиц к модулю упругости модифицированных наночастиц.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Высокое пространственное разрешение АСМ в совокупности с простотой подготовки образцов и возможностью работы в жидкой среде позволяют применять разработанный подход для изучения поверхностных свойств разнообразных модифицированных и немодифицированных наночастиц. Полученные результаты позволяют заключить, что измерение степени поверхностной модификации наночастиц методом АСМ в режиме спектроскопии представляется перспективным направлением и эффективным средством регистрации уникальных характеристик комплексов наночастиц с биоорганическими молекулами.
Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (государственный контракт № 14.740.11.1065 от 24 мая 2011 г.).
Рецензенты:
- Ярополов Александр Иванович, д.х.н., профессор, заведующий лабораторией химической энзимологии Института биохимии им. А. Н. Баха РАН, г. Москва.
- Еремин Сергей Александрович, д.х.н., профессор, заведующий группой иммунохимических методов анализа кафедры энзимологии Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, г. Москва.