Исследование эффектов негативного действия ксенобиотиков экосистемы на здоровье человека остается актуальной проблемой здравоохранения. Ионы тяжелых металлов и их соли располагаются на приоритетном месте среди ксенобиотиков вследствие того, что в окружающей среде, по результатам регулярного мониторинга Роспотребнадзора, их концентрации довольно часто превышают допустимый уровень. Анализ и систематизация данных мировой литературы по изучению негативных влияний солей тяжелых металлов на живые системы и разработке способов защиты от их воздействия объясняют важность подобных исследований широкой распространенностью этих соединений в биосистеме [1, 2]. В ряду экологических токсикантов свинец занимает одно из лидирующих мест, так как является поливалентным ядом и вызывает тяжелые поражения внутренних органов [3, 4]. Опасность отравления особенно высока в промышленных зонах с повышенным содержанием свинца и его солей в почве и водных источниках из-за устойчивости соединений свинца и способности аккумулироваться в растениях, организме животных и человека [5, 6].
Проникая в организм, свинец накапливается в кровеносной системе, в аорте и важных для жизни органах: в почках и печени. Вызывая анемию и гипоксию тканей органов, свинцовая соль уксусной кислоты вызывает усиление окислительных процессов, нарушение NO-продуцирующей функции и образование основных вазодилататоров – оксидов азота (NOх). Формируется общий патологический процесс, называемый «дисфункция эндотелия», одним из проявлений которой является нарушение баланса между факторами, расширяющими и суживающими кровеносные сосуды, в пользу последних. Два общих патологических процесса – окислительный стресс и нарушение функции эндотелиоцитов – способствуют дисфункции ренальной ткани, а также гепатоцита и кардиомиоцита. Данные литературы свидетельствуют, что хроническая интоксикация свинцом сопровождается его аккумуляцией в почках, при этом повреждается ее структурная организация [7]. Анализ показателей основных процессов мочеобразования при свинцовой интоксикации демонстрирует увеличение объема мочи, выделение натрия из-за понижения показателя трансканальцевого транспорта воды и натрия. В токсическом эффекте свинца на нефрон выявляется участие Na+/K+-АТФ-азы как ведущей составляющей Na-насоса, определяющего в канальцах почек возврат ионов в кровь [8].
Сведения литературы свидетельствуют о нарушении окислительно-восстановительного потенциала клетки как основного фактора токсичности соли свинца. Исследователи предлагают использовать препараты с антиоксидантными свойствами, способные оказывать противовоспалительное действие и обеспечить реализацию ингибирования окислительного стресса и других негативных проявлений [9, 10]. Получены результаты, свидетельствующие о благоприятном действии афобазола при ишемии мозга и миокарда в экспериментах на крысах [11]. Более того, следует отметить наличие положительного влияния препарата на соотношение между индуцибельной и эндотелиальной NO-синтазами (eNOS). Вместе с тем показано, что регуляторы воспроизводства eNOS – L-аргинин и N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) могут моделировать эффекты ацетата свинца, а также оказывать влияние на результаты афобазола [12]. Вышеизложенное послужило причиной выполнения данного исследования.
Цель исследования – изучение эффектов действия афобазола и его комбинации с L-аргинином при сатурнизме на особенности изменений про- и антиокислительных реакций, обмен NO, холестерина и оценка функции клеток ренальной и печеночной тканей.
Материалы и методы исследования. В моделировании использовали крыс линии Wistar половозрелого возраста, массой 230–250г (n=60). Все экспериментальные процедуры на животных были проведены в соответствии с этическим стандартом, закрепленным правовыми актами РФ, принципом Базельской декларации и в соответствии с рекомендациями этического Комитета ИБМИ, протокол № 6 от 26 декабря 2018г.
Для выбора дозы ацетата свинца проводили исследования для определения DL50, далее постепенно сокращали количество вводимого вещества до получения его минимальной концентрации, способной вызвать изменения изучаемых показателей. Контрольную группу составили животные в количестве 10 особей, в 1-ю группу были включены животные (10 особей), которым вводили уксуснокислый свинец (5 мг/кг массы крысы) в течение 30 дней, крысам 2-й и 3-й групп (по 10 особей в каждой) вводили L-аргинин или его модификацию L-NAME в дозах 10мг/кг и 25мг/кг соответственно в течение 30 дней; животные 4-й и 5-й группы (по 10 особей в группе) получали афобазол в дозе 10 мг/кг массы тела и его комбинацию с аминокислотой. По окончании интоксикационного периода и влияния фармакологических препаратов у контрольных и опытных крыс под рауш-наркозом из сердца забирали кровь в пробирки с цитратом натрия, затем ее центрифугировали для получения плазмы. Дважды промытую физиологическим раствором эритроцитарную массу подвергали лизису. Извлеченные образцы тканей почек и печени гомогенизировали при температуре +4оС. В плазме крови, в ренальной и печеночной тканях исследовали уровень диальдегида малоновой кислоты (МДА), а также концентрацию медьсодержащего белка – церулоплазмина (ЦП), активность антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Определяли содержание в крови общего холестерина (ОХС) и ХС липопротеинов низкой (ХС ЛПНП) и высокой плотности (ХС ЛПВП), а также концентрацию конечных стабильных метаболитов оксида азота (NOх) (цит. по С.Г.Дзугкоеву) [13]. Методом вестерн-блота определяли уровень воспроизводства eNOS в эндотелии аорты. Функциональную активность Na+/K+-АТФазы (натрий-калиевой аденозинтрифосфатазы) в гомогенатах ренальной ткани и гепатоцитов исследовали по методу Т.С.Scou (1957). О нарушении функции печени судили по результатам активности специфичных для органов энзимов в плазме крови: аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) и экскреторного энзима – щелочной фосфатазы (ЩФ).
Проводили статистическую обработку по программе Microsoft Excel 2006, результаты которой выражали в виде среднего значения (M) и ошибки среднего (±m). Достоверность различий между группами определяли по t-критерию Стьюдента и считали p<0,05 уровнем статистической значимости.
Результаты исследования и их обсуждение. Присутствие свинца в организме человека и животных нарушает структурную организацию гемоглобина и вызывает анемизацию и гипоксию клеток тканей органов. При гипоксии образуются активные формы кислорода (АФК), которые активируют общий патологический процесс – перекисное окисление липидов (ПОЛ) в мембранах клеток, в частности почечной и печеночной тканей. Несмотря на физиологическую роль свободно-радикального окисления (СРО), необходимого для обновления фосфолипидов и регуляции метаболизма в мембранах клеток, его усиление может привести к развитию патологических процессов. Следует отметить, что одной из причин недостатка L-аргинина и нарушения его биодоступности для eNOS может быть участие этого энзима в цикле синтеза мочевины. Литературные данные свидетельствуют о повышенном содержании мочевины в крови при сатурнизме [14].
Исследование влияния аналога асимметричного диметиларгинина (АДМА) – L-NAME на активность ПОЛ и уровень NOх показало повышение содержания МДА, что сопровождалось значимым понижением уровня NOх. Введение 10 мг/кг L-аргинина подопытным животным на фоне интоксикации соли свинца показало противоположный результат: снижение в крови содержания МДА и повышение концентрации NOx. Подавление интенсивности липопероксидации из-за действия L-аргинина было вызвано возросшей активностью СОД и улучшенной динамикой в уровнях каталазы и ЦП (табл. 1). В регуляторном механизме экспрессии и активности eNOS играет роль присутствие индуктора экспрессии eNOS – L-аргинина, ингибирующего действие L-NAME. Нормализуя окислительно-восстановительные реакции, L-аргинин стимулировал уровень экспрессии eNOS и, соответственно, продукцию NOx как основного вазодилататора. В экспериментальных условиях длительная хроническая интоксикация, обусловленная инъекцией уксуснокислой соли свинца (5 мг/кг веса животного) длительностью 30 дней, способствовала нарушениям метаболических и функциональных показателей. Результаты исследования демонстрируют повышение концентрации вторичного продукта ПОЛ – МДА в гемолизате эритроцитов, гомогенатах коркового и мозгового слоев интерстиция почечной и печеночной тканей. Развитию окислительного стресса наряду с АФК способствовала несостоятельность антиоксидантных ферментов. Наши результаты свидетельствовали о снижении в гемолизате эритроцитов активности СОД. В противоположность этому имело место повышение уровня активности каталазы и содержания ЦП в сыворотке крови. Такая динамика активности каталазы и содержания ЦП является проявлением защитной компенсаторной реакции в условиях свинцовой интоксикации. Значительно выраженное усиление реакций окисления при сатурнизме вызвало понижение содержания NOх в плазме крови. Следует отметить, что соотношение этих показателей в эксперименте характеризуется наличием отрицательной взаимосвязи. Причинами недостаточной продукции NO являются следующие факторы: неадекватное содержание аминокислоты, ее превращение в модифицированное производное – АДМА, снижение биодоступности L-аргинина для еNOS и уровня экспрессии энзима. Дополнительную роль в изменении биодоступности аминокислоты к еNOS сыграло изменение обмена ХС. Исследование состояния метаболизма ХС при интоксикационном синдроме показало повышение уровня общего ХС и ХС ЛПНП, при этом ХС ЛПВП был достоверно снижен. Перекисной модификации в ЛПНП подвергается и белковый компонент апопротеин В-100, обеспечивающий взаимодействие с рецепторами ЛПНП и их поглощение клетками. Одновременно повреждаются перенос L-аргинина к еNOS и продукция NO. Однако этого не происходит, поэтому ЛПНП, взаимодействуя со скавенджер-рецепторами, поглощаются макрофагами, обеспечивающими развитие пре- и атерогенных изменений в сосудистом эндотелии. Неадекватное содержание L-аргинина и ингибирование его биодоступности становятся причиной недостаточного воспроизводства еNOS. Этот факт, имеющий место на фоне ацетата свинца, свидетельствует о снижении в эндотелии аорты крыс уровня экспрессии еNOS в среднем на 58,2%. На основании литературных данных причиной изменения уровня воспроизводства еNOS и функциональной активности фермента может быть окисление кофакторов, особенно тетрабиоптерина (ВН4), приводящее к разобщению в молекуле еNOS оксигеназного и редуктазного доменов и снижению продукции NO de novo. Ряд метаболических изменений: процесс окислительной деградации липидов, недостаток оксида азота – NOх, гиперхолестеринемия и гипер-β-липопротеинемия – являются причиной изменения кровотока в сосудах микроциркуляторного русла в почечной и печеночной тканях. Данные свидетельствуют о снижении активности Na+/K+-АТФ-азы в интерстиции коркового и мозгового вещества ренальной ткани, а также в гепатоците. В качестве основного корректора выявленных метаболических и функциональных нарушений был использован афобазол, наряду с регуляторами экспрессии eNOS препятствующий процессам окисления и восстанавливающий гидрофобность цитоплазматических мембран на молекулярном уровне путем встраивания в них сигма-1 рецепторы. Данный препарат одновременно повышал сродство взаимодействия ХС с рецепторами ЛПНП, обеспечивая при этом его транспорт в клетки.
Афобазол при внутримышечном введении на фоне сатурнизма показал статистически значимое понижение выраженности липопероксидации по данным содержания МДА в эритроцитах, почечной и печеночной тканях. Происходило статистически значимое повышение активности СОД, а активность каталазы и концентрация ЦП снизились, что способствовало устранению дисбаланса в АОС (табл. 1). Наибольшая эффективность афобазола была выявлена при его введении в комплексе с L-аргинином.
Данные, приведенные в таблице 1, отображают эффекты афобазола и его комплекса с L-аргинином на активность СРО и ферментативную составляющую эндогенной системы антиоксидантной защиты клеток. При повышении активности СОД происходит снижение уровня супероксид-анион радикала и образования перекиси водорода. Ингибирование окислительного стресса под влиянием комплекса афобазола с L-аргинином вызвало более значительное повышение уровня NOx в крови (табл. 1). Данные показали положительный эффект афобазола на обмен ХС: снижение уровня ОХС, ХС ЛПНП и повышение ХС ЛПВП в крови. Сочетание афобазола с L-аргинином показало более выраженный результат на улучшение в обмене ХС, соотношения между содержанием атерогенных ЛПНП и противоатерогенных ЛПВП.
Таким образом, объективность полученных результатов весьма доказательно свидетельствует о подавляющем влиянии афобазола самостоятельно и в комбинации с L-аргинином на липопероксидацию, содержание NOх и ХС. Следует отметить, что нормализация окислительно-восстановительных реакций и обмена ХС афобазолом с аминокислотой вызвала более значительное повышение уровня NOх в плазме крови.
Таблица 1
Метаболические показатели крови, почечной и печеночной тканей на фоне афобазола и его комплекса с L-аргинином при сатурнизме у крыс
|
Показатели
|
Контроль |
Ацетат свинца |
Ацетат свинца + L-NAME
|
Ацетат свинца + L-аргинин
|
Ацетат свинца + афобазол
|
Ацетат свинца + афобазол + L-аргинин |
|
МДА, эритроциты, нмоль/мл |
4,70±0,47 |
6,29±0,34111) |
6,58±0,022222) |
6,01±0,023333) |
5,36±0,074444) |
5,13±0,01555) 666) |
|
МДА, корковое вещество почки, нмоль/мг белка |
3,19±0,02 |
5,51±0,021111) |
5,78±0,022222) |
5,21±0,043333) |
4,78±0,014444) |
4,14±0,035555) 6666) |
|
МДА, мозговое вещество почки, нмоль/мг белка |
4,25±0,02 |
5,17±0,021111) |
5,54±0,022222) |
5,16±0,023333) |
4,60±0,014444) |
4,13 ±0,025555) 6666) |
|
МДА, печень, нмоль/мг белка |
1,74±0,02 |
3,35±0,041111) |
3,59±0,032222) |
3,21±0,023333) |
2,49±0,024444) |
2,20±0,0175555) 6666) |
|
СОД, эритроциты, усл. ед, |
88,28±1,51 |
54,48±0,321111) |
52,22±0,272222) |
57,67±0,283333) |
69,38±0,174444) |
77,69±0,265555) 6666) |
|
Каталаза, сыворотка крови, мкат/л |
226,96±1,10 |
382,88±0,381111) |
396,88±0,732222) |
371,38±0,753333) |
301,11±0,324444) |
278,09±0,765555) 6666) |
|
ЦП, сыворотка крови, мг/л |
338,36±2,36 |
444,61±5,851111) |
449,59±2,232222) |
419,39±2,253333) |
386,91±2,674444) |
377,78±2,5155) 6666) |
|
NOx, сыворотка крови, мкМ |
50,49±0,51 |
28,90±0,321111) |
29,86±0,282222) |
30,94±0,373333) |
41,06±0,374444) |
45,13±0,215555) 6666) |
|
ОХС, ммоль/л |
1,80±0,04 |
4,83±0,051111) |
5,09±0,032222) |
4,40±0,053333) |
3,41±0,034444) |
2,70±0,045555) 6666) |
|
ХС ЛПВП, ммоль/л |
0,79±0,04 |
0,25±0,021111) |
0,19±0,022222) |
0,30±0,02333) |
0,61±0,034444) |
0,74±0,03555) 6666) |
|
ХС ЛПНП, ммоль/л |
1,01±0,03 |
4,11±0,081111) |
4,51±0,062222) |
3,74±0,073333) |
2,509±0,054444) |
2,12±0,055555) 6666) |
Примечание:
1111)– р<0,001, 111)– р<0,01– достоверность ацетата свинца относительно контроля;
2222)– р<0,001 – достоверность Ацетат свинца + L-NAME относительно контроля;
3333)– р<0,001, 333)– р<0,01, 33)– р<0,02 – достоверность Ацетат свинца + L-аргинин относительно Ацетат свинца + L-NAME;
4444)– р<0,01– достоверность Ацетат свинца + афобазол относительно Ацетат свинца + L-NAME,
5555)– р<0,01, 555)– р<0,01,.55)– р<0,02– достоверность Ацетат свинца + афобазол + L-аргинин относительно Ацетат свинца + афобазол;
6666)– р<0,001, 666)– р<0,01, 66)– р<0,02– достоверность Ацетат свинца + афобазол + L-аргинин относительно Ацетат свинца
Анализируя данные, полученные в ходе исследования, можно утверждать о способности афобазола (в виде монотерапии) ингибировать процесс переокисления в эритроцитах и гомогенатах ренальной и печеночной тканей и восстанавливать молекулярную структуру клеточных мембран путем встраивания в них сигма-1 рецепторов. Применение афобазола привело к восстановлению гидрофобности клеточных мембран ренальной и печеночной тканей, что обеспечило нормализацию липид-липидных и липид-белковых взаимодействий. Доказательством этих влияний в клетках внутренних органов являются данные функциональной активности Na+/K+-АТФ-азы, демонстрирующие позитивное влияние препарата афобазола и его комплекса с L-аргинином (табл. 2).
Таблица 2
Влияние афобазола и его комплекса с L-аргинином на активность Na,K-АТФ-азы в клетках органов и уровень органоспецифических ферментов в плазме крови при свинцовой интоксикации у крыс
|
Показатели
|
Контроль
|
Ацетат свинца
|
Ацетат свинца + L-NAME
|
Ацетат свинца + L-аргинин
|
Ацетат свинца + афобазол
|
Ацетат свинца + афобазол + L-аргинин |
|
Na+/K+-АТФ-аза (мкмольРн/мг белка/час) |
||||||
|
Почка (корковый слой) |
4,42±0,02 |
1,30±0,0031111) |
1,2±0,022222) |
1,8±0,023333) |
2,31±0,024444) |
3,01±0,035555) 6666) |
|
Почка (мозговой слой) |
6,66±0,03 |
3,34±0,021111) |
3,2±0,022222) |
3,60±0,023333) |
4,23±0,024444) |
5,69±0,015555) 6666) |
|
Печень |
1,31±0,01 |
0,38±0,011111) |
0,31±0,012222) |
0,6±0,013333) |
0,86±0,014444) |
0,95±0,025555) 6666) |
|
Специфические печеночные ферменты |
||||||
|
АлАТ, мкмоль/с*л |
1,11±0,01 |
2,1±0,0031111) |
2,33±0,032222) |
1,95±0,023333) |
1,6±0,014444) |
1,32±0,025555) 6666) |
|
АсАТ, мкмоль/с*л |
1,03±0,02 |
2,7±0,031111) |
2,85±0,022222) |
2,50±0,033333) |
1,60±0,024444) |
1,19±0,015555) 6666) |
|
ГГТП, нмоль/с*л |
543,89±4,91 |
1108,4±17,921111) |
1270±30,582222) |
817±14,343333) |
764,6±3,834444) |
625±14,925555) 6666) |
|
ЩФ, нмоль/с*л |
350,2±5,01 |
754,0±9,081111) |
837,95±3,942222) |
608,0±4,433333) |
542,1±13,484444) |
449±10,075555) 6666) |
Примечание: мкмольРн/мг белка/ч, где Рн – неорганический фосфор;
1111)– р<0,001 – достоверность ацетата свинца относительно контроля;
2222)– р<0,001 – достоверность Ацетат свинца + L-NAME относительно контроля;
3333)– р<0,001, 333)– р<0,01, 33)– р<0,02 – достоверность Ацетат свинца + L-аргинин относительно Ацетат свинца + L-NAME;
4444)– р<0,01 – достоверность Ацетат свинца + афобазол относительно Ацетат свинца + L-NAME,
5555)– р<0,001, 555)– р<0,01, 55)– р<0,02– достоверность Ацетат свинца + афобазол + L-аргинин относительно Ацетат свинца + афобазол; 6666– р<0,001, 666)– р<0,01, 66)– р<0,02– достоверность Ацетат свинца + афобазол + L-аргинин относительно Ацетат свинца
Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о статистически значимом повышении активности Na+/K+-АТФ-азы в корковом и мозговом слоях почечной ткани, а также в гепатоците. О восстановлении гидрофобности клеточной мембраны гепатоцита свидетельствует снижение в плазме крови органоспецифических энзимов и экскреторного фермента – ЩФ.
Заключение. Интоксикация ацетатом свинца приводит к активации окислительных реакций, снижению антиоксидантного статуса за счет угнетения активности СОД, повышая при этом интенсивность ПОЛ в эритроцитах, почечной и печеночной тканях. Развивающийся окислительный стресс нарушает взаимодействия между оксигеназным и редуктазным доменами eNOS и соответственно способствует понижению содержания NOх. Другой причиной ингибирования синтеза монооксида азота является влияние модифицированного производного L-аргинина – L-NAME на биодоступность L-аргинина к eNOS, а также структурные изменения в эндотелии сосудов, вызванные атерогенными ЛПНП. Результаты являются вполне доказательными и свидетельствуют о пониженном уровне экспрессии eNOS при сатурнизме, продукции NOх, нарушении микроциркуляторной гемодинамики в нефроне и гепатоците. Метаболические нарушения характеризуются угнетением функции Na+-насоса – Na+/K+-АТФ-азы в клетках коркового и мозгового слоев почек и печени.
Корригирующие фармакологические препараты афобазол с L-аргинином при интоксикации ацетатом свинца показали свое эффективное влияние на показатели окислительного стресса, метаболизм оксида азота и его доступность для eNOS. Торможение липопероксидации афобазолом и его комплексом с L-аргинином показало значительное увеличение уровня NOх. Другим вспомогательным фактором, повышающим биодоступность L-аргинина для eNOS, оказалось снижение уровня общего ХС и ХС ЛПНП.
Таким образом, полученные данные установили способность афобазола, его комплекса с L-аргинином тормозить процессы переокисления в крови, почечной и ренальной тканях и, соответственно, повышать продукцию NOх и активность Na+/K+-АТФ-азы в ренальной и печеночной тканях при интоксикационном синдроме. Наряду с этим на фоне афобазола и его комплекса с L-аргинином происходит снижение повышенного уровня специфичных для органов ферментов в плазме крови сравнительно с данными при сатурнизме.