Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

Щипицын М.А.

Изучение адгезивных взаимодействий клеток друг с другом и с компонентами экстрацеллюлярного матрикса являются в настоящее время одной из актуальных проблем как молекулярной биологии [Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995], так и медико-биологических дисциплин, использующих теоретическую базу фундаментальных наук для объяснения процессов патогенеза и возможностей лечения заболеваний человека. Исследование взаимодействий макрофага с эритроидными и другими гемопоэтическими клетками представляется интересным в связи с тем, что данная проблема еще пока находится на стадии изучения [Hamamura K. et al.,1996; Kristin L. Goltry., 1997]. Кроме того, адгезивные контакты эритроидных клеток с макрофагом, в составе эритробластических островков (ЭО), являются моделью изучения адгезивных взаимодействий клеток друг с другом.

Цель настоящей работы заключалась в выявлении особенностей адгезивных свойств ЭО различных классов зрелости, а также сравнение адгезии ЭО к субстрату у самцов и самок крыс.

Материалы и методы. В работе были использованы интактные крысы (10 самцов); крысы, подвергнутые острой кровопотере (30 самцов) и посттрансфузионной полицитемии (7 самцов)

Посттрансфузионная полицитемия.

Для изучения влияния ингибирования эритропоэза у животных на адгезивную функцию ЭО однократно внутрибрюшинно вводили 80% взвесь гомологичных эритроцитов крысам-реципиентам в количестве 7,0 мл на 100 г массы тела. Периферическую кровь и костный мозг крыс-реципиентов исследовали на 5 сутки посттрансфузионной полицитемии.

Кровопотеря.

В качестве классической модели стимуляции эритропоэза была использована кровопотеря (Дымшиц Р.А., 1958). Кровь у животных забирали из хвостовых вен в количестве 2% от массы тела крыс. Исследования периферической крови и костного мозга проводили на 1, 3, 7, 10 и 14 сутки после кровопотери.

Получение препаратов костного мозга.

Препараты эритробластических островков (ЭО) и клеток костного мозга из бедренных костей крыс получали по методу Ю.М. Захарова и соавторов (1984). Клеточную взвесь разводили средой выделения (среда Игла для культур клеток – 66 %; 10%-ый раствор человеческого альбумина – 33%; гепарин– 5 тыс. ед./100 мл среды) и помещали на квадратные предметные стекла, при этом зона с разведённой клеточной взвесью была ограничена на препарате резиновым кольцом. Далее стекла помещали в термостат при T=37°С и при 100% влажности на 45 минут. За это время ЭО и клетки костного мозга оседали и адгезировались.

Метод гидродинамического воздействия

на препараты костного мозга.

Для сравнения силы адгезивного взаимодействия ЭО различных классов зрелости с субстратом нами была предложена оригинальная методика гидродинамического воздействия на препараты костного мозга [Рассохин А.Г., Щипицын М.А., 2002; Щипицын М.А., 2005]. После инкубации в термостате стекла вынимали и производили смывы с областей адгезии поршневым автоматическим медицинским дозатором А-2 по 1 мл (Министерство медицинской промышленности СССР, ВПО «Союзмедприбор», Одесское производственное объединение «Медлабортехника», 1985). На область адгезии первой группы стекол производили один смыв (1 мл среды Игла), второй группы стекол –десять смывов, с третьей- пятьдесят смывов (по 1 мл среды Игла). Средняя кинетическая энергия струи жидкости (среда Игла), подаваемой из сопла дозатора, оставалась постоянной. Для расчёта гидродинамического давления мы использовали уравнение Бернулли:

Э=p+γ·h+(ρ·V2)/2=const,

где (1)

p-«статическое давление» (пьезоэлектрический напор), давление, сжимающее частицу жидкости;

γ·h-изменение давления при изменении высоты на величину h;

(ρ·V2)/2-«динамическое давление» (скоростной напор).

 Жидкость в цилиндре дозатора А-2 находится под давлением, создаваемом поршнем. Данное давление намного больше, чем давление, создаваемое весом жидкости, следовательно, изменениями давления по высоте столба (h) жидкости можно пренебречь и считать истечение жидкости, находящейся в замкнутом сосуде под давлением p. Поэтому мы определили линейную среднюю скорость истечения жидкости из сопла дозатора (0,764 м/с). В этих случаях можно считать константу в уравнении Бернулли (1) постоянной по всему объёму текущей из сопла жидкости и равной p, давлению в цилиндре дозатора, так как скоростью течения жидкости в цилиндре можно пренебречь вследствие того, что площадь сечения цилиндра много больше сечения отверстия сопла дозатора.

Преобразовав уравнение Бернулли, мы рассчитывали только гидродинамическую составляющую давления, создаваемого поршнем дозатора:

Pгидродин= (ρ·V2)/2,

где(2)

ρ≈1000 кг/м3 (плотность среды Игла),

V=0,764 м/с (линейная скорость жидкости на выходе из сопла).

Таким образом, подставив вышеуказанные значения в уравнение (2), гидродинамическое давление жидкости оказалось равным 292 Па.

Приготовление препаратов.

После смывов края стекла промакивали салфеткой, помещали в полистироловые чашки Петри (35мм) и центрифугировали при 1000 об/мин 40-45 секунд (для лучшего распластывания клеток). Стекла высушивали на воздухе и фиксировали метиловым спиртом. Затем препараты окрашивали гематологическим красителем по Романовскому-Гимза. Общее количество ЭО подсчитывали на всем препарате под малым увеличением (x600), количество ЭО выражали на 1 смпрепарата. Для оценки количества ЭО различных классов (формула ЭО) зрелости препарат анализировали под большим увеличением (x1350) с масляной иммерсией.

Методы статистического анализа.

 Для анализа данных использовали пакеты прикладных программ Statistica (StatSoft, USA), редактора электронных таблиц MS Excel 2000. Для проверки гипотезы о виде распределения пользовались критерием нормальности Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между двумя независимыми группами исследуемых показателей с помощью непараметрического аналога критерия Стьюдента – критерий Колмогорова–Смирнова. Непрерывные переменные представлены в виде M±SE (среднее арифметическое ± стандартная ошибка).

Результаты. Общее количество ЭО на 1 см2 препарата достоверно снижалось с увеличением кратности смывов со стекла. О силе адгезивного взаимодействия ЭО с субстратом (стеклом) мы судили по отношению количества ЭО, оставшихся на препарате после однократного смыва, к количеству ЭО на препаратах, подвергшихся 50-тикратному смыву. Общее количество ЭО интактных самцов на препаратах уменьшилось в 1,274 раза с 1283±48 (1-кратный смыв) до 1007±43 (50-тикратный смыв) на 1 см(р<0,05), а количество ЭО на препаратах, полученных из костного мозга крыс после острой кровопотери (на 1-ые сутки) уменьшилось с 2278±103 (1-кратный смыв) до 857±80 (50-тикратный смыв), то есть в 2,66 раза (p<0,05). В то время, как на прапаратах, полученных из костного мозга полицитемичных животных, убывание среднего количества ЭО на 1 смпрепаратов с увеличением кратности смывов составляло 1,52 раз (р<0,05). Следовательно, можно сделать заключение о том, что при изменённых состояниях эритропоэза адгезия ЭО к стеклу уменьшается в большей степени после острой кровопотери (стимуляция эритропоэза) и в меньшей степени на 5-ые сутки посттрансфузионной полицитемии (угнетение эритропоэза). Следует отметить, что как при постгеморрагической анемии, так и после посттрансфузионной полицитемии, адгезия ЭО к стеклу остаётся ниже, чем у ЭО интактных животных. Анализ количества ЭО различных классов зрелости на 1 смпрепарата также выявил снижение их количества с увеличением кратности смывов, кроме того, мы наблюдали отличия в паттерне убывания количества ЭО разных классов зрелости. Вероятно, это связано с особенностями динамики перестройки, синтеза и развёртывания рецепторов адгезии центрального макрофага ЭО и окружающих его эритробластов в период интенсивной пролиферации и созревания. Таким образом, предложенная нами оригинальная методика гидродинамического воздействия на препараты ЭО костного мозга позволила выявить один из аспектов функциональной гетерогенности ЭО различных классов зрелости в ответе на различные эритропоэз- стимулирующие и угнетающие факторы.