Профилактика и лечение сосудистых заболеваний головного мозга является в настоящее время важной и актуальной задачей во всем мире. Инсульт – это серьезная проблема общественного здравоохранения, поскольку ежегодно около 15 миллионов человек во всем мире переносят инсульт [1; 2]. В нашей стране инсульт поражает более 450 000 человек в год, заболеваемость и смертность от острых нарушений мозгового кровообращения находится на 2-м месте среди других заболеваний. Для того чтобы избежать высокой смертности и инвалидности, необходимо раннее выявление и адекватное лечение инсульта, а также обязательное проведение реабилитационных мероприятий, которые препятствуют возникновению рецидива. Одним из компонентов реабилитации является медикаментозная терапия с использованием церебропротекторных, ноотропных и стресс-протекторных препаратов. Одним из перспективных направлений создания новых препаратов, обладающих церебропротекторным действием, является разработка инновационных соединений на основе пептидных биорегуляторов.
Новое потенциальное лекарственное средство (ЛС) на основе пептидэргического нейро- и стресс-протектора Nα-ацетил-D-лизил-лизил-аргинил-аргинил-амид является кандидатным препаратом для лечения нарушений мозгового кровообращения. Проведенные ранее доклинические исследования специфической фармакологической активности потенциального ЛС показали его высокую нейропротекторную эффективность in vivo [3]. Было показано, что данное потенциальное ЛС обладает антиишемической, антигипоксической, ноотропной и актопротекторной активностями [4]. Выявлено, что Nα-ацетил-D-лизил-лизил-аргинил-аргинил-амид, являющий активным фармакологическим ингредиентом потенциального ЛС, оказывает интегральное нейропротекторное действие, нормализует уровень провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α, а также повышает содержание противовоспалительного интерлейкина-4 в головном мозге. Защитное действие пептида при церебральной ишемии характеризуется также нейротрофическим компонентом.
Целью данной работы являлись доклинические исследования острой и хронической токсичности потенциального ЛС «Лизаргам» на основе пептидэргического нейро- и стресс-протектора для лечения нарушений мозгового кровообращения.
Материалы и методы исследования
Исследуемое потенциальное ЛС «Лизаргам, спрей назальный дозированный 0,5% и 1,0%» (далее потенциальное ЛС «Лизаргам»), один флакон потенциального ЛС содержит активный фармацевтический ингредиент («D-лизаргам, ацетат») – 15 (0,5%) или 30 (1,0%) мг; физиологический раствор (ФР) - 3,0 мл; D-маннит - 30 мг. «D-лизаргам, ацетат» представляет собой синтетический тетрапептид последовательности Nα-ацетил-D-лизил-лизил-аргинил-аргинил-амид в виде ацетатной соли. Терапевтическая доза потенциального ЛС у человека составляет 20 мкг/кг. Эта доза рассчитывалась исходя из данных по изучению специфической активности потенциального ЛС на экспериментальных животных и коэффициента экстраполяции доз мышей и крыс на человека в соответствии с руководством Т.А. Гуськовой [9].
Доклинические исследования были выполнены на основе рекомендаций действующих методических документов [5-7]. Животные поступили из питомника РАМН «Рапполово» Ленинградской области. Основные правила содержания и ухода соответствовали правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.). Объем работ и перечень процедур был одобрен биоэтической комиссией института. Исследования проводили на 3 видах животных: белых беспородных крысах обоего пола (масса 180-200 грамм, возраст 9–10 недель), белых беспородных мышах обоего пола (19–21 г, 9–10 недель) и на кроликах породы шиншилла обоего пола (2-2,5 кг, 2-3 месяца).
Острая токсичность потенциального ЛС была изучена на мышах, крысах и кроликах. Период наблюдения после введения возрастающих доз составил 14 дней, для достижения высоких доз потенциальное ЛС вводили многократно в течение 10 часов. Эксперименты были проведены при интраназальном (и/н) и внутривенном (в/в) введении потенциального ЛС по одинаковым схемам. Мыши и крысы были случайным образом разделены на группы (по 5 самок и 5 самцов). В опытных группах мышам и крысам и/н вводили потенциальное ЛС в дозах 2, 20, 50 мг/кг; в/в - в дозах 20, 200, 500 мг/кг. И/н потенциальное ЛС вводилось животным при помощи автоматической одноканальной пипетки 10-100 мкл с соответствующим наконечником, введение осуществлялось в каждый носовой ход. В/в введение производилось в соответствии с требованиями [6], в максимальной дозе 500 мг/кг (50 мл/кг) каждой крысе вводили не более 2 мл за раз с интервалом 2 часа в течение 10 часов. Кролики были случайным образом разделены на группы (по 3 самки и по 3 самца в каждой). Кроликам в опытной группе потенциальное ЛС вводили и/н в дозе 25 мг/кг, в/в - в дозе 400 мг/кг. В контрольных группах животным по тем же схемам вводили ФР.
Во всех экспериментах проводили наблюдение за лабораторными животными в течение 14 суток после введения потенциального ЛС. Проводили клинический осмотр (ежедневно) до начала эксперимента (фоновые значения), а также выполняли взвешивание на 2, 7 и 14-й день после введения. У крыс и кроликов измеряли частоту сердечных сокращений (ЧСС) и частоту дыхательных движений (ЧДД). На 14-е сутки все животные были подвергнуты эвтаназии и патоморфологическому исследованию.
Оценка местнораздражающего действия была проведена на 3 кроликах-самцах. На слизистую оболочку правого глаза наносили 0,1 мл 1% потенциального ЛС, на слизистую оболочку левого глаза - 0,1 мл ФР. Наблюдение проводили в течение 24 часов с момента нанесения потенциального ЛС.
Испытания на пирогенность были проведены на кроликах-самцах и соответствовали требованиям ГФ XIII, ОФС 1.2.4.0005.15 [8]. Потенциальное ЛС вводили в ушную вену в объеме 0,2 мл/кг. Температуру измеряли 2 раза до начала исследования и каждые 30 минут в течение 3 часов после введения потенциального ЛС.
Хроническая токсичность потенциального ЛС была изучена на крысах, случайным образом разделенных на 4 группы (по 15 самок и 15 самцов в каждой). Потенциальное ЛС вводили и/н ежедневно, в течение 90 дней в 3 дозах: 1 мг/кг (50-кратная терапевтическая доза для человека, минимально возможная для экспериментального введения крысам), 3 и 5 мг/кг. Хроническая токсичность потенциального ЛС была также изучена на кроликах, самцах и самках, которые были случайным образом разделены на группы (по 3 самки и 3 самца в каждой). Потенциальное ЛС вводили и/н ежедневно, в течение 90 дней в 3 дозах: терапевтической дозе для кролика - 0,06 мг/кг (доза рассчитана путем умножения терапевтической дозы для человека на коэффициент пересчета по площади поверхности тела кролика 3,2); 3 мг/кг и максимальной - 5 мг/кг (более чем в 250 раз превышающей терапевтическую дозу для человека). Крысам и кроликам в контрольных группах по той же схеме вводили ФР.
Клинический осмотр животных выполняли ежедневно, в течение эксперимента регистрировали интегральные показатели состояния организма всех животных, а также патоморфологическое и патогистологическое исследования по окончании эксперимента. Физиологические исследования проводили до начала исследования, а также на 30-й и на 90-й день после начала введения потенциального ЛС.
Офтальмологическое исследование проводили на тех же сроках, оценивая состояние слизистых оболочек, наличие правильных роговичных рефлексов и измеряя величину зрачка и ширину глазной щели. Для лабораторных исследований собирали образцы крови и костный мозг.
Клинический анализ крови выполняли на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus Junior vet5 (Diatron, Венгрия) и на мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Биохимические показатели в сыворотках крови (аланинаминотрансфераза (АлАТ), аспартатаминотранфераза (АсАТ), билирубин, глюкоза, креатинин, мочевина, общий белок, холестерин, щелочная фосфатаза) оценивали на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Chem-7 (Erba, Чехия). Исследование мочи выполняли на экспресс-анализаторе мочи DocUReader (ANALYTICON Biotechnologies AG, Германия). Кроме того, проводили микроскопический анализ миелограммы на мазках смывов костного мозга и подсчет количества клеток костного мозга. Все тесты выполнялись по стандартным протоколам и инструкциям производителей наборов.
На основании результатов эксперимента по изучению хронической токсичности рассчитывали расчетный безопасный курс (РБК) и индекс безопасности (ИБ) потенциального ЛС при клиническом применении в соответствии с инструкцией Т.А. Гуськовой [9].
Патоморфологическое исследование после завершения экспериментов включало в себя некропсию, макроскопическое исследование и взвешивание внутренних органов. Также рассчитывали отношение массы органа к массе тела.
Патогистологическое исследование было выполнено с использованием образцов тканей, полученных от животных, которым вводили потенциальное ЛС в максимальной дозе, а также образцов тканей от животных контрольных групп. Материал фиксировали в 10%-ном формалине, обезвоживали, заключали в парафин и изготовляли гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином («Биовитрум», Россия). Препараты изучали в световом микроскопе DMLB (Leica Microsystems AG, Германия).
Статистический анализ проводили с помощью программы Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation). Подсчитывали средние значения и ошибки среднего (М±m). Сравнение показателей между группами проводили с помощью непарного Т-критерия Стьюдента с неравными отклонениями, а также по U-критерию Манна-Уитни. Отличия считали достоверными при р<0,05.
Результаты и их обсуждение
- Оценка острой токсичности на мышах и крысах
При интраназальном введении потенциального ЛС в дозах до 50 мг/кг крысам и мышам летальных эффектов не было зарегистрировано. Ежедневный клинический осмотр не выявил каких-либо симптомов интоксикации животных ни в одной из групп в течение эксперимента. Таким образом, дозы потенциального ЛС, вызывающие возможные летальные эффекты при и/н введении, находятся заведомо выше 50 мг/кг.
При внутривенном введении потенциального ЛС в дозах до 500 мг/кг у крыс и мышей летальных эффектов не наблюдали (таблицы 1 и 2). Было выявлено, что после введения доз 200 и 500 мг/кг у животных отмечалась гиподинамия, одышка, тремор всего тела и взъерошенность, при этом симптомы интоксикации проходили в течение 3 часов и носили дозозависимый характер. В дальнейшем в течение эксперимента клинический осмотр не выявил каких-либо симптомов интоксикации животных ни в одной из групп. Полученные результаты показали, что при в/в введении потенциального ЛС летальность экспериментальных животных отсутствовала, то есть дозы, вызывающие возможные летальные эффекты при в/в введении, выше 500 мг/кг.
Таблица 1
Отсутствие летальных эффектов при внутривенном введении потенциального лекарственного средства «Лизаргам» мышам (пало/всего)
|
Доза, мг/кг |
2 |
20 |
200 |
500 |
|
Эффект (самцы) |
0/5 |
0/5 |
0/5 |
0/5 |
|
Эффект (самки) |
0/5 |
0/5 |
0/5 |
0/5 |
Таблица 2
Отсутствие летальных эффектов при внутривенном введении потенциального лекарственного средства «Лизаргам» крысам (пало/всего)
|
Доза, мг/кг |
2 |
20 |
200 |
500 |
|
Эффект (самцы) |
0/5 |
0/5 |
0/5 |
0/5 |
|
Эффект (самки) |
0/5 |
0/5 |
0/5 |
0/5 |
Во всех группах экспериментальных животных после и/н или в/в введения потенциального ЛС не было обнаружено влияния на массу тела грызунов, при этом отмечалась тенденция к увеличению массы животных к 14-му дню эксперимента, связанная с естественным приростом массы тела. Введение испытуемого потенциального ЛС крысам также не привело к достоверному влиянию на ЧСС, ЧДД и ректальную температуру экспериментальных животных.
Во всех группах наружный осмотр животных не выявил отклонений от нормы. Результаты вскрытия показали, что положение внутренних органов было анатомически правильным, а сами органы без патологических изменений. Патоморфологическое исследование, а также расчет массовых коэффициентов внутренних органов всех экспериментальных групп крыс и мышей не выявили каких-либо значимых различий между группами животных, получавшими потенциальное ЛС или ФР. Учитывая, что разовая терапевтическая доза для человека составляет в среднем 0,020 мг/кг, можно заключить, что дозы потенциального ЛС, превосходящие предполагаемую терапевтическую дозу для человека в 2500 и 1250 раз, не токсичны для мышей и крыс и для кроликов соответственно.
- Оценка острой токсичности на кроликах
При интраназальном введении потенциального ЛС кроликам в дозе 25 мг/кг летальных эффектов не наблюдалось. Ежедневный клинический осмотр также не выявил каких-либо симптомов интоксикации животных ни в одной из групп в течение эксперимента.
При внутривенном введении потенциального ЛС в дозе 400 мг/кг летальных эффектов у кроликов не отмечали, однако наблюдалась значительная клиническая картина интоксикации. Сразу же после введения у животных отмечалось боковое положение, одышка, при этом основные рефлексы были сохранены. Состояние нормализовалось в течение часа. В дальнейшем ежедневный клинический осмотр после введения потенциального ЛС не выявил каких-либо симптомов интоксикации животных ни в одной из групп в течение эксперимента.
У кроликов во всех группах (как при и/н, так и при в/в введении потенциального ЛС) отмечали тенденцию к увеличению массы животных к 14-м суткам опыта. Не было выявлено влияния потенциального ЛС на массу тела, на ЧСС, ЧДД и ректальную температуру кроликов. Патоморфологическое исследование, а также расчет массовых коэффициентов внутренних органов всех экспериментальных групп животных не выявили каких-либо значимых различий между группами кроликов, которым вводили потенциальное ЛС или ФР (таблицы 3). Таким образом, дозы, превышающие терапевтическую дозу для человека в 1250 раз при и/н введении или в 20 000 раз при в/в введении, не токсичны для кроликов.
Таблица 3
Массовые коэффициенты (МК) органов у кроликов (г/кг веса тела) при остром внутривенном введении потенциального лекарственного средства «Лизаргам»
|
Орган |
M±m |
|||
|
Контроль
|
Лизаргам, 400 мг/кг |
|||
|
Самцы |
Самки |
Самцы |
Самки |
|
|
Сердце |
3,0±0,2 |
2,9±0,1 |
3,1±0,1 |
3,2±0,1 |
|
Легкие с трахеей |
4,5±0,2 |
4,6±0,2 |
4,6±0,2 |
4,5±0,2 |
|
Тимус |
1,7±0,1 |
1,8±0,1 |
1,7±0,1 |
1,6±0,1 |
|
Печень |
36,2±0,5 |
36,7±0,4 |
37,0±0,3 |
36,1±0,4 |
|
Селезенка |
0,64±0,06 |
0,62±0,05 |
0,62±0,04 |
0,64±0,04 |
|
Почки |
7,4±0,2 |
7,2±0,2 |
7,3±0,2 |
7,1±0,1 |
|
Надпочечники |
0,09±0,01 |
0,10±0,01 |
0,10±0,01 |
0,09±0,01 |
|
Головной мозг |
3,4±0,2 |
3,3±0,1 |
3,3±0,1 |
3,2±0,1 |
|
Семенники или яичники |
1,8±0,1 |
0,12±0,02 |
1,8±0,1 |
0,13±0,01 |
- Изучение местнораздражающего действия
При оценке местнораздражающего действия потенциального ЛС «Лизаргам» наблюдение за кроликами в течение 24 часов не выявило отека или гиперемии глаз экспериментальных животных, то есть потенциальное ЛС не обладало раздражающим действием при местном применении.
- Испытание на пирогенность
При испытаниях на пирогенность было показано, что после введения потенциального ЛС в группе из 3 кроликов суммарное повышение температуры составило 0,4 °С, то есть не превышало 0,6 °С. В соответствии с критериями фармакопеи ОФС 1.2.4.0005.15 такие результаты свидетельствуют об отсутствии пирогенности изучаемого потенциального ЛС.
- Изучение хронической токсичности на крысах
На протяжении эксперимента гибели подопытных животных не наблюдали, что свидетельствовало об отсутствии кумуляции потенциального ЛС в организме. Ежедневный клинический осмотр животных не выявил каких-либо значимых различий между экспериментальными группами на протяжении всего эксперимента. Не было отмечено значительных различий по массе тела, количеству потребления корма и воды между всеми экспериментальными группами.
Проведенные физиологические исследования (регистрация структуры поведения крыс в открытом поле, регистрация спонтанной двигательной активности (СДА), регистрация показателей функции внешнего дыхания, регистрация электрокардиограммы (ЭКГ), регистрация артериального давления (АД), регистрация болевой чувствительности и офтальмологическое исследование) не выявили различий в показателях между опытными и контрольной группами крыс как на 30-й, так и на 90-й день после начала введения потенциального ЛС (таблица 4). Также было показано, что применение потенциального ЛС «Лизаргам» не влияет на физиологические показатели (ЧДД, ЭКГ, ЧСС, АД, болевую чувствительность и ректальную температуру).
Таблица 4
Влияние ежедневного интраназального введения потенциального лекарственного средства «Лизаргам» на структуру поведения крыс в открытом поле
|
Показатель |
М±m |
|||
|
Контроль |
Лизаргам, 1 мг/кг |
Лизаргам, 3 мг/кг |
Лизаргам, 5 мг/кг |
|
|
Фон |
||||
|
Горизонтальная активность |
44,9±1,2 |
45,4±1,6 |
45,6±1,5 |
44,8±1,4 |
|
Вертикальная активность |
14,7±1,1 |
15,2±1,3 |
15,5±1,1 |
14,5±1,3 |
|
Заглядывания |
5,3±0,5 |
5,3±0,6 |
5,6±0,4 |
5,2±0,5 |
|
Груминг |
2,2±0,2 |
2,3±0,2 |
2,5±0,2 |
2,5±0,3 |
|
Акты дефекации |
2,2±0,2 |
2,1±0,2 |
2,4±0,3 |
2,2±0,2 |
|
30-е сутки |
||||
|
Горизонтальная активность |
45,2±1,5 |
44,8±1,5 |
44,6±1,2 |
45,2±1,6 |
|
Вертикальная активность |
15,2±1,2 |
15,0±1,4 |
15,1±1,3 |
14,8±1,4 |
|
Заглядывания |
5,4±0,4 |
4,8±0,5 |
5,5±0,4 |
5,2±0,7 |
|
Груминг |
2,3±0,3 |
2,3±0,2 |
2,3±0,2 |
2,5±0,2 |
|
Акты дефекации |
2,2±0,2 |
2,1±0,2 |
2,0±0,3 |
2,1±0,3 |
|
90-е сутки |
||||
|
Горизонтальная активность |
44,8±1,3 |
45,3±1,5 |
44,5±1,6 |
45,5±1,7 |
|
Вертикальная активность |
14,5±1,3 |
15,4±1,1 |
15,0±1,5 |
15,3±1,6 |
|
Заглядывания |
5,3±0,4 |
5,7±0,4 |
5,6±0,6 |
5,9±0,5 |
|
Груминг |
2,4±0,2 |
2,3±0,3 |
2,2±0,2 |
2,5±0,3 |
|
Акты дефекации |
2,2±0,2 |
2,5±0,2 |
2,0±0,3 |
2,3±0,3 |
Примечание: в таблице приведены данные для крыс-самцов, для самок получены аналогичные результаты.
По результатам теста «Сила хватки», позволяющего оценить влияние потенциального ЛС на нервно-мышечную функцию, значимых различий между экспериментальными группами по данному параметру не наблюдалось (таблица 5).
Таблица 5
Влияние ежедневного интраназального введения потенциального лекарственного средства «Лизаргам» на силу хватки крыс (г)
|
Сроки |
М±m |
|||||||
|
Контроль |
Лизаргам, 1 мг/кг |
Лизаргам, 3 мг/кг |
Лизаргам, 5 мг/кг |
|||||
|
Самцы |
Самки |
Самцы |
Самки |
Самцы |
Самки |
Самцы |
Самки |
|
|
Фон |
760±19 |
730±17 |
756±19 |
728±16 |
753±18 |
725±18 |
763±17 |
732±16 |
|
30-е сутки |
985±17 |
929±15 |
976±18 |
934±19 |
979±17 |
927±18 |
981±18 |
924±17 |
|
90-е сутки |
1083±17 |
1029±17 |
1094±18 |
1024±20 |
1094±19 |
1036±19 |
1092±15 |
1028±18 |
Анализ результатов лабораторных исследований, проведенных на 30-й и 90-й день эксперимента у крыс, не выявил статистически значимых изменений в гематологических показателях, а также уровнях ферментов печени, глюкозы, общего белка в сыворотке крови как в контрольных, так и в опытных группах. Не было выявлено различий, вызванных введением потенциального ЛС, в относительном содержании разных типов клеток миелограммы, общем количестве клеток костного мозга, а также по уровням маркеров повреждения почек, анализу состава мочи и оценке функциональной активности почек.
На основании результатов хронического эксперимента был рассчитан индекс безопасности (ИБ) при клиническом применении: крысы – доза 5 мг/кг; длительность введения – 90 дней. Гибели нет.
Расчетный безопасный курс (РБК) = (5 мг/кг х 90)/ (0,02 мг/кг х 5.9)=3814 дней.
Индекс безопасности (ИБ) для трехмесячного терапевтического курса = 3814/90 = 42.
В соответствии с классификацией опасности лекарственных препаратов для клинического применения (ИБ > 5) потенциальное ЛС «Лизаргам, спрей назальный» относится к III классу малотоксичных лекарственных препаратов.
- Изучение хронической токсичности на кроликах
Ежедневный клинический осмотр кроликов всех экспериментальных групп не выявил каких-либо значимых различий между группами, гибели подопытных животных не наблюдалось. Измерение массы тела показало, что данный параметр равномерно увеличивался на протяжении всего срока исследования как в контрольной, так и во всех опытных группах. Анализ показателей массы тела, потребления корма и воды, а также физиологических параметров (ЧДД, ЭКГ и ЧСС и АД) показал, что достоверные различия между всеми экспериментальными группами отсутствуют. Офтальмологическое исследование не выявило различий между экспериментальными группами, получавшими потенциальное ЛС или ФР.
Представленные в таблице 6 данные подтверждают, что ежедневное и/н введение потенциального ЛС в дозах 0,06-5 мг/кг в течение 30 и 90 дней не оказывало значительного влияния на количественный и качественный состав периферической крови кроликов. Также не было выявлено влияния потенциального ЛС на состояние красного костного мозга, биохимический состав крови, мочи и функциональную активность почек.
Таблица 6
Оценка влияния ежедневного интраназального введения потенциального лекарственного средства «Лизаргам» на показатели периферической крови кроликов-самцов
|
Показатель |
М±m |
|||
|
Контроль |
Лизаргам, 0,06 мг/кг |
Лизаргам, 3 мг/кг |
Лизаргам, 5 мг/кг |
|
|
30-е сутки |
||||
|
Количество лейкоцитов (WBC), 109/л |
18,86±0,27 |
19,74±0,71 |
19,34±0,64 |
19,80±1,42 |
|
Количество эритроцитов (RBC), 1012/л |
6,06±0,23 |
6,18±0,18 |
6,47±0,24 |
6,54±0,34 |
|
Концентрация гемоглобина (HGB), г/л |
118,0±3,6 |
111,3±3,8 |
111,7±3,2 |
121,3±4,5 |
|
Гематокрит (HCT), % |
48,30±1,80 |
48,76±4,20 |
48,50±3,63 |
47,2±3,35 |
|
Средний объем эритроц. (MCV), фл |
75,3±3,7 |
80,0±2,6 |
74,0±3,1 |
75,0±3,5 |
|
Средн. содерж. гемоглоб. в эритр. (MCH), пг |
18,1±1,0 |
18,7±1,3 |
18,1±1,1 |
20,8±1,6 |
|
Ср. концентрация гемоглобина в эритроц. (MCHC), г/дл |
256,3±20,6 |
217,7±23,5 |
243,3±17,6 |
254,7±16,8 |
|
Широта распределения эритроцитов (RDWc), % |
15,8±0,2 |
15,9±0,3 |
16,0±0,3 |
15,8±0,9 |
|
Кол-во тромбоцитов (PLT), 109/л |
383,7±15,4 |
383,7±23,8 |
384,7±16,0 |
383,0±22,5 |
|
Средний объем тромбоцита (MPV), фл |
6,0±0,4 |
6,7±0,6 |
7,4±0,8 |
6,3±0,7 |
|
Тромбокрит, (PCT), % |
0,30±0,05 |
0,34±0,03 |
0,30±0,05 |
0,29±0,04 |
|
Широта распределения тромбоцитов (PDWc), % |
30,2±0,9 |
32,4±1,8 |
30,0±1,3 |
30,1±0,5 |
|
Нейтрофилы, 109/л |
7,52±0,43 |
6,88±0,36 |
6,51±0,40 |
6,70±1,00 |
|
Базофилы, 109/л |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Эозинофилы, 109/л |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Моноциты, 109/л |
1,03±0,21 |
1,50±0,20 |
1,20±0,40 |
1,27±0,19 |
|
Лимфоциты, 109/л |
10,32±0,84 |
11,36±0,88 |
11,64±0,90 |
11,83±1,64 |
|
90 сутки |
||||
|
Количество лейкоцитов (WBC), 109/л |
17,99±2,61 |
18,42±1,11 |
20,28±1,46 |
17,01±0,99 |
|
Количество эритроцитов (RBC), 1012/л |
6,98±1,36 |
7,66±0,83 |
6,66±0,80 |
6,73±0,80 |
|
Концентрация гемоглобина (HGB), г/л |
123,3±4,9 |
109,7±5,8 |
111,0±7,4 |
111,7±5,2 |
|
Гематокрит (HCT), % |
47,84±2,10 |
49,15±1,60 |
49,39±3,50 |
48,34±4,20 |
|
Средний объем эритроц. (MCV), фл |
75,3±5,2 |
78,3±2,0 |
76,3±4,8 |
75,0±4,5 |
|
Средн. содерж. гемоглоб. в эритр. (MCH), пг |
17,3±1,3 |
18,4±0,6 |
17,5±1,2 |
18,8±0,7 |
|
Ср. концентрация гемоглобина в эритроц. (MCHC), г/дл |
247,7±17,5 |
222,0±14,1 |
227,3±23,6 |
228,7±23,1 |
|
Широта распределения эритроцитов (RDWc), % |
16,1±0,9 |
16,7±1,0 |
16,2±0,6 |
16,5±0,8 |
|
Кол-во тромбоцитов (PLT), 109/л |
384,7±17,4 |
384,3±2,7 |
382,7±11,5 |
383,7±15,6 |
|
Средний объем тромбоцита (MPV), фл. |
6,9±0,3 |
6,3±0,4 |
6,9±0,5 |
6,2±0,8 |
|
Тромбокрит, (PCT), % |
0,30±0,05 |
0,29±0,04 |
0,40±0,03 |
0,40±0,05 |
|
Широта распределения тромбоцитов (PDWc), % |
30,5±2,0 |
31,5±1,9 |
30,4±1,3 |
30,2±1,4 |
|
Нейтрофилы, 109/л |
6,99±1,29 |
5,97±1,50 |
8,30±1,00 |
6,20±0,70 |
|
Базофилы, 109/л |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Эозинофилы, 109/л |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Моноциты, 109/л |
1,40±0,20 |
0,89±0,16 |
1,02±0,37 |
0,95±0,20 |
|
Лимфоциты, 109/л |
9,60±1,67 |
11,55±2,03 |
10,96±1,87 |
9,86±0,52 |
Примечание: в таблице приведены данные для кроликов-самцов, для самок получены аналогичные результаты.
Патоморфологическое исследование на 90-й день эксперимента, проведенное у животных всех экспериментальных групп (крысы, кролики), не показало отклонений от нормы и не выявило различий, связанных с длительным и/н введением потенциального ЛС. По результатам взвешивания внутренних органов животных не было выявлено различий по массовым коэффициентам органов между экспериментальными группами. Анализ результатов патогистологического исследования не показал значимых патологических изменений в тканях крыс и кроликов, которым вводили «Лизаргам» в максимальной в дозе, не было выявлено различий между опытными и контрольными группами.
На основании результатов эксперимента на кроликах был также рассчитан ИБ потенциального ЛС при клиническом применении.
Расчетный безопасный курс (РБК) = (5 мг/кг х 90)/ 0,02 мг/кг х 3,2=7031 день.
Индекс безопасности (ИБ) для трехмесячного терапевтического курса = 7031/90 = 78,
что позволяет отнести потенциальное ЛС «Лизаргам» к III классу малотоксичных лекарственных препаратов.
Заключение
Таким образом, изучение острой токсичности потенциального ЛС «Лизаргам» показало, что при интраназальном введении дозы, превосходящие предполагаемую терапевтическую дозу для человека в 2500 и 1250 раз, не токсичны для грызунов и для кроликов соответственно. При внутривенном введении было выявлено, что дозы, превосходящие предполагаемую терапевтическую дозу для человека в 25 000 тысяч раз для грызунов и в 20 000 тысяч раз для кроликов, оказывают преходящий токсический эффект, но при этом летальных исходов у животных не наблюдаются. Потенциальное ЛС является апирогенным и не оказывает местнораздражающего действия.
При изучении хронической токсичности было показано, что потенциальное ЛС в дозах до 5 мг/кг (что в 250 раз превосходит терапевтическую дозу для человека) при ежедневном 90-дневном введении абсолютно не токсично для лабораторных животных (крыс и кроликов).
В соответствии с классификацией опасности лекарственных препаратов для клинического применения потенциальное ЛС «Лизаргам, спрей назальный дозированный» на основе пептидэргического нейро- и стресс-протектора, предназначенный для лечения нарушений мозгового кровообращения, имеет индекс безопасности > 5 и относится к III классу малоопасных лекарственных препаратов.
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Исследование выполнено по Государственному контракту № 14.N08.11.0096 от 25 августа 2016 г. «Доклинические исследования лекарственного средства на основе пептидэргического нейро- и стресс-протектора для лечения нарушений мозгового кровообращения» в рамках ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу».