Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF LACTOBACILLI ISOLATED FROM FECES OF HEALTHY PEOPLE LIVING IN THE RUSSIAN FEDERATION AND KAZAKHSTAN

Chervinets V.M. 1 Chervinets Yu.V. 1 Belyaeva E.A. 1 Lebedev S.N. 1 Charkova A.R. 1 Troshin A.V. 1 Danilenko V.N. 2 Urdabaev Z.K. 3 Zharasov M.Z. 3 Zevalkina E.V. 3
1 Tver state medical university
2 Institute of General Genetics of the Russian Academy of Sciences named by N.I.Vavilov
3 West Kazakhstan State Medical University named by Marat Ospanov
Выделено 27 штаммов лактобацилл от здоровых коренных жителей Казахстана и 22 штамма лактобацилл от жителей ЦФО РФ. При изучении ферментативной активности штаммов лактобацилл, выделенных от жителей Западного Казахстана, в большей степени выявлены ферменты, утилизирующие нутриенты животного происхождения, инозитол, гликоген, глицерол, и в меньшей – растительного. Лактобациллы жителей ЦФО более активны в отношении растительных компонентов - метил-βD-глюкопиранозида, D-раффинозы, D-арабинозы. Лактобациллы жителей Казахстана обладали низкой и средней антагонистической активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и не действовали на дрожжевые грибы рода Candida; адгезивные свойства практически отсутствовали. Лактобациллы, выделенные от жителей ЦФО РФ, показали высокий антагонизм к грамположительным и грамотрицательным условно-патогенным и патогенным бактериям и грибам рода Candida; адгезивные свойства соответствовали средним показателям.
It was isolated 27 strains of lactobacilli from healthy indigenous people of Kazakhstan and 22 strains of lactobacilli from residents of the Central Federal District of the Russian Federation. The Lactobacillus strains isolated from residents of western Kazakhstan, increasingly produce enzymes that dispose of animal nutrients, inositol, glycogen, glycerol, and to a lesser - of vegetable. Lactobacilli isolated from population of the CFD more active against plant components - methyl-βD-glucopyranoside, D-raffinose, D-arabinose. Lactobacilli from residents of Kazakhstan have low and medium antagonistic activity against gram-negative and gram-positive pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms and are not acted on the yeast fungi of the genus Candida; adhesive properties were practically absent. Lactobacilli isolated from population of the Central Federal District of the Russian Federation, showed a high antagonism to the gram-positive and gram-negative opportunistic and pathogenic bacteria and fungi of the genus Candida; adhesive properties correspond to the average indicators.
lactobacilli
healthy people
Russian Federation
Kazakhstan

Известно, что фенотипические и генотипические признаки одного вида микроорганизмов, выделенных от различных людей в разных регионах, могут отличаться [1-4; 15].

Способность к адгезии кишечных лактобацилл изучают, используя клетки линий Caco-2 и HT29-MTX. G.J. Chauviere с соавторами [6] обнаружил, что не все штаммы лактобацилл адгезировались на энтероцитоподобных клетках Caco-2, указывая на штаммоспецифичность. Выявлено, что L.acidophilus BG2FO4 и LB, L. rhamnosus DR20, L. acidophilus HN017, L. casei Shirota, L. rhamnosus LC-705 прикрепляются к энтероцитоподобным клеткам Caco-2 [10].

Адгезия лактобацилл происходит за счет пассивных сил, электростатического и гидрофобного взаимодействия, а также специфических структур [7]. L. johnsonii La1 проявляет высокую кальцийнезависимую адгезивность по отношению к культуре клеток Caco-2. Выделен поверхностный протеин L. fermentum 104R с молекулярной массой 29 kDa, который может вызывать адгезию, участвуя в прикреплении этого штамма к слизистой оболочке тонкого кишечника [12]. Установлено, что липотейхоевая кислота отвечает за адгезию L. johnsonii La1. L. fermentum имеет поверхностные лектиноподобные структуры белковой природы, благодаря которым штамм проявляет свои адгезивные свойства [8].

Установлено, что многие штаммы L. casei и L. plantarum имеют выраженный добавочный слой - гликокаликс, который можно рассматривать в качестве их адгезина. В то же время штаммы L. fermentum и L. acidophilus гликокаликса не имеют, или же он слабо выражен, и адгезия последних связана с другими структурами клеточной оболочки лактобацилл [8].

Таким образом, лактобациллы содержат большое количество разнообразных внешних структур, отвечающих за взаимодействие с эпителиальными клетками кишечника.

Недавние исследования показали, что несколько штаммов, идентифицированных с помощью API® 50 CHL как L. plantarum, оказались микроорганизмами вида L. pentosus, что было выявлено молекулярно-генетическими методами. В API® 50 CHL также отсутствуют профили базы данных видов L. gasseri, L. jensenii, L. iners и L. vaginalis, что может привести к неверной идентификации [9; 14]. В то же время установлено, что результаты идентификации видов L. plantarum, L. fermentum, L. acidophilus, L. delbrueckii, L. casei, L. rhamnosus, полученные с использованием полимеразной цепной реакции, соответствуют результатам классического биохимического метода идентификации на основе сахаролитической активности различных видов лактобацилл [5].

Бактерии рода Lactobacillus обладают бродильным типом метаболизма, обладают способностью сбраживать лактозу при помощи р-галактозидазы. Образующиеся в ходе расщепления лактозы глюкоза и галактоза вступают на путь катаболизма гексоз по фруктозо-1,6-бисфосфатному пути (гликолиз) или по пентозофосфатному пути. Особенности катаболизма гексоз определяют подразделение представителей рода на две биохимические группы: гомо- и гетероферментативные лактобациллы (которые наряду с молочной кислотой образуют значительное количество газа и ароматические вещества) [11]. Примеры гомоферментативных молочнокислых бактерий: L. casei, L. acidophilis. Примеры гомоферментативных молочнокислых бактерий: L. fermentum, L. brevis.

Получены данные, что 22% L. plantarum, выделенных из молочных продуктов Украины, не синтезировали биогенных аминов, и большинство штаммов лактобацилл не выделяло ацетон [13].

Цель работы: в сравнительном аспекте определить биохимическую активность, адгезивные и антагонистические свойства лактобацилл, выделенных от коренных жителей ЦФО РФ и Западного Казахстана.

Методика

Материалом для исследования послужили фекалии, выделенные от здоровых людей в возрасте 19-21 года, постоянно проживающих в Центральном федеральном округе РФ и Западном Казахстане. Лактобациллы выделяли из фекалий путем посева на среду МРС «HI Media» (Индия) и культивирования при 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 3-5%. Идентификация проводилась по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам с использованием API®50 CHL «Bio Mérieux Vitek, Inc.».

Первичное исследование антагонизма лактобацилл к тестовым культурам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов проводили согласно методике прямого антагонизма; после биохимической идентификации антагонистическую способность микроорганизмов выявляли методом отсроченного антагонизма по Л.П. Блинковой (2003). В качестве тест-культур были использованы следующие штаммы: Candida albicans АТСС 885-653, Salmonella enterica Typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941 из коллекции культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; Bacillus subtilis 534 из коллекции МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского; Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича. В качестве контроля использовался штамм Lactobacillus plantarum 8RA-3 из коллекции МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского с известным спектром антагонистической активности.

Адгезивную активность лактобацилл определяли, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу В.И. Брилис (1986) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате выделено 27 штаммов лактобацилл от здоровых коренных жителей Казахстана и 22 штамма – от жителей ЦФО РФ.

При определении биохимических свойств лактобацилл выявлено, что 6 штаммов, выделенных от жителей ЦФО РФ, принадлежат к виду L. fermentum. Данный вид не выделялся из кишечника здоровых коренных жителей Казахстана. Метил-βD-глюкопиранозид ферментировали L. fermentum только в 33%.

К виду L. plantarum было отнесено 13 штаммов, выделенных от жителей Казахстана, и 15 - от жителей ЦФО РФ. D-тагатозу (15%), L-фукозу (8%), крахмал (8%), гликоген (8%), глицерол (15%) и D-арабит (46%) ферментировали только L. plantarum, выделенные у жителей Казахстана. Штаммы L. plantarum, выделенные от жителей ЦФО, ферментировали метил-βD-глюкопиранозид и L-сорбозу в 100% случаев. D-арабинозу ферментировали только штаммы (25%), выделенные от жителей ЦФО (рис. 1).

Вид L. rhamnosus был идентифицирован у 10 штаммов, выделенных от жителей Казахстана, и у 9 - от жителей ЦФО РФ. Глицерол (30%) и D-ликсозу (10%) ферментировали L. rhamnosus, выделенные только у жителей Казахстана. D-раффинозу ферментировали 25% штаммов, выделенных только от жителей ЦФО (рис. 2).

К виду L. paracasei отнесены 3 штамма, выделенные от жителей Казахстана, 2 - от жителей ЦФО РФ. В 67% случаев штаммы L. paracasei, выделенные только у жителей Казахстана, ферментировали инозитол.

Рис. 1. Биохимическая активность L. plantarum, выделенных от жителей ЦФО РФ и Казахстана

Адгезия на культуре клеток. Значения среднего показателя адгезии (СПА) лактобацилл, выделенных от жителей Западного Казахстана – 0,95, что соответствует отсутствию адгезивных свойств. Лактобациллы у жителей ЦФО РФ (2,48) обладали среднеадгезивными свойствами.

Антагонистическая бактериальная активность лактобацилл, выделенных от жителей Казахстана, уступает таковой у жителей ЦФО РФ примерно в 2 и более раза в отношении грампозитивных и грамнегативных микроорганизмов, а противогрибковая активность совершенно отсутствует по отношению к дрожжевым грибам рода Candida (таблица).

Ферментативная активность штаммов лактобацилл, выделенных от жителей Западного Казахстана, адаптирована к традиционной мясной пище. В большей степени выявлены ферменты, утилизирующие нутриенты животного происхождения, и в меньшей – растительного. Так, отмечена активность в отношении инозитола, раффинозы, гликогена, туранозы, метил-βD-глюкопиранозида.

Рис. 2. Биохимическая активность L. rhamnosus, выделенных от жителей ЦФО РФ и Казахстана

Лактобациллы жителей ЦФО более активны в отношении растительных компонентов: метил-βD-глюкопиранозида, D-раффинозы, D-арабинозы.

Антагонистическая активность лактобацилл

№ п/п

Тест культуры микроорганизмов

Антагонистическая активность лактобацилл жителей Казахстана в мм (M±m)

Антагонистическая активность лактобацилл жителей ЦФО РФ в мм

(M±m)

1.

Candida albicans АТСС 885-653

0±0

8,6±4,5

2.

Salmonella enterica Typhimurium 415

11,0±2,0

27,7,0±1,6

3.

Shigella sonnei I фазы 941

13,2±2,1

18,2±6,2

4.

Escherichia coli АТСС 25922

11,5±2,3

27,2±0,8

5.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

14,1±1,9

27,6±0,7

6.

Staphylococcus aureus АТСС 25923

14,3±2,3

28,1±1,5

7.

Bacillus subtilis 534

16,3±2,5

25,2±0,6

Лактобациллы жителей Казахстана обладали низкой и средней антагонистической активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов и не действовали на дрожжевые грибы рода Candida, адгезивные свойства практически отсутствовали. Лактобациллы, выделенные от жителей ЦФО РФ, выгодно отличались своим высоким антагонизмом к грамположительным и грамотрицательным бактериям и грибам рода Candida. Адгезивные свойства соответствовали средним показателям.

Вывод. Лактобациллы, выделенные от жителей Западного Казахстана и ЦФО РФ, отличаются друг от друга ферментативной активностью, способностью к адгезии и активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам. У лактобацилл жителей ЦФО РФ более выражена протективная и персистирующая активность по сравнению с лактобациллами жителей Казахстана. Лактобациллы коренных жителей Западного Казахстана показали более выраженную ферментативную активность в расщеплении животных компонентов пищи, в то время как лактобациллы жителей ЦФО РФ были более активны в отношении растительных. Этот факт нужно учитывать при создании новых эффективных пробиотиков на основе лактобацилл.