Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

THE CONTENTS OF NEUROSPECIFIC ALPHA-GLOBULINS IN FETAL, MATURE, AND NEOPLASTIC BRAIN TISSUE

Myasnyankin A.A. 1 Kokhanov A.V. 1
1 Astrachan State Medical University
С помощью самостоятельно разработанных иммунохимических тест-систем на два нейроспецифических белка (НСБ) исследованы их уровни в экстрактах эмбриональной, дефинитивной и опухолевой ткани мозга. Установлено, что термостабильный α1-глобулин мозга и кислотостабильный α2-глобулина мозга обнаруживаются в ткани мозга плода начиная с 9–12 недель внутриутробного развития, и к третьему триместру беременности их концентрация приближается к уровням НСБ, соответствующим мозгу взрослого (5940±1292 нг/мл для α1-ТС-глобулина и 6150±1583 нг/мл для α2-КС-глобулина мозга). В экстрактах опухолевых тканей мозга обнаружено достоверное снижение содержания альфа-глобулинов мозга и наблюдается феномен антигенного упрощения. Изучено содержание α1-ТС- и α2-КС-глобулинов мозга в экстрактах немозговых опухолей и подтвержден для этих НСБ феномен антигенной дивергенции. Методом ИФА исследованы уровни α1-ТС- и α2-КС-глобулинов мозга в сыворотке крови больных с опухолевыми заболеваниями головного мозга. Полученные данные позволяют предполагать, что тест на α1-ТС-глобулин мозга в сыворотке крови больных с мезенхимальными опухолями может иметь дифференциально-диагностическое значение в неврологии и нейрохирургии.
With independently developed immunochemical test systems for two neurospecifical protein (NSP) were studied their levels in extracts of fetal, mature, and neoplastic brain tissue. It was found that the thermostable α1-globulin and acid-stable α2-globulin are detected in the fetal brain tissue, starting with 9-12 weeks of fetal development, and to the third trimester of pregnancy, their concentration is approaching to the levels of the NSP, the appropriate adult brain (5940±1292 ng / ml for the thermostable α1-globulin and 6150±1583 ng / ml for the acid-stable α2-globulin of brain). In extracts of brain neoplastic tissue was detected a significant decrease in the content of the brain alpha-globulin and was observed the phenomenon of antigenic simplification. The content of alpha-1-TS- and alpha-2-AS-globulins in extracts of non-brain tumor was studied and for these NSP was confirmed the phenomenon of antigenic divergence. By the method of ELISA are investigated the levels of brain alpha-1-TS- and alpha-2-AS-globulins in the serum of patients with neoplastic diseases of the brain. The data suggest that the test for brain alpha-1-TS-globulin in serum of patients with mesenchymal tumors may have a differential diagnostic value in neurology and neurosurgery.
neurospecific proteins
brain thermostable and acid-stable alpha-globulin
physical and chemical properties
immunochemical analysis
fetal and neoplastic brain tissue

Изучение антигенного состава такого важного органа человека, как головной мозг, и такой важной ткани, как нервная, представляет значительный интерес не только с точки зрения анализа структурной антигенной дифференцировки нервной ткани, но и, учитывая забарьерное расположение головного мозга, может иметь важное практическое значение в случае находок нейроспецифических белков (НСБ) в крови больных с травмами, нервно-психическими, воспалительными и опухолевыми заболеваниями центральной нервной системы [1, 3]. Несмотря на то что за 50-летний период появились сообщения о более чем 65 НСБ, научное направление, связанное с их изучением, продолжает активно развиваться как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах [2, 4, 6–8, 10].

К концу 1960-х гг. методами иммунохимического анализа было доказано наличие в составе головного мозга органоспецифических антигенов [11]. Наиболее известными представителями нейроспецифических белков являются белок S-100 [11, 12], нейроспецифическая енолаза (NSE или антиген 14–3–2) [9, 12], глиофибриллярный кислый антиген (GFAP) [6, 12] и основной белок миелина (MBP) [5, 10].

Совершенствование техники фракционирования белков, применение методов иммунохимического анализа значительно расширили наши знания об антигенном составе нервной ткани [2–5].

Основная масса водорастворимых тканевых и сывороточных белков, в том числе НСБ, денатурирует в экстремальных физико-химических условиях, и для их выделения и очистки требуются достаточно мягкие физиологические условия фракционирования [3]. Однако существует небольшая группа НСБ, способных сохранять свои нативные свойства при жестких методах фракционирования [6]. К таким белкам-«экстремалам» относятся описанные нами ранее нейробелки: термостабильный альфа1-глобулин и кислотостабильный альфа2-глобулин.

Вследствие большой функциональной важности подобных антигенов, способных принимать участие в процессах запоминания, миелинизации или аутоиммунных конфликтах, представляет большой интерес исследование локализации и динамики изменения уровней этих НСБ в ткани мозга в процессе эмбриогенеза и малигнизации.

Цель исследования: анализ содержания нейроспецифических альфа-глобулинов в эмбриональной, дефинитивной и опухолевой мозговой ткани.

Материалы и методы исследования

Биологический материал получали в бюро судебно-медицинской экспертизы г. Астрахани в виде аутопсийного материала мозга от лиц, погибших от случайных причин (48 образцов), мертворожденных плодов второго-третьего триместров гестации (23 образца) и абортивного материала (эмбрионы первого триместра гестации). Аутопсийный и биопсийный материал опухолей нервной ткани получен из патологоанатомических бюро различных клиник г. Астрахани. Злокачественные образования мозга были представлены 34 образцами нейроэктодермальных опухолей различной степени анаплазии (I степени – 15 и II степени – 19) и 22 образцами мезенхимальных опухолей (арахноэндотелиомы – 18 и саркомы – 6). Экстракты мозга готовились на 0,05М трис-глициновом буфере (рН 8,3) без добавления детергентов в соотношении 1 : 3 (ткань : буфер).

Пробы крови брали из локтевой вены у 83 больных нейрохирургических отделений с опухолями мозга в стандартных условиях. Образцы сыворотки крови отбирали по 1,5 мл в две пластиковые пробирки «Эппендорф» для исследования и хранили при температуре –25°С до анализа. Контролем служили 68 образцов сывороток крови доноров обоего пола, полученных из областной станции переливания крови, в возрасте от 30 до 56 лет.

Антисыворотки к термостабильному альфа1-глобулину (α1-ТС–глобулину) и кислотостабильному альфа2-глобулину (α2-КС-глобулину) мозга получали путем иммунизации кроликов по схеме, описанной ранее [3, 6]. В полученных моноспецифических антисыворотках к НСБ, хорошо работающих в иммунодиффузионном анализе, определялся титр антител, и, если он превышал 1/32, моноспецифическая антисыворотка признавалась гипериммунной, пригодной для активации планшетов и приготовления конъюгатов в ИФА.

Для иммунохимической идентификации и количественного определения в экстрактах этих НСБ применяли методы иммунодиффузии по Оухтерлони, радиальной иммунодиффузии по Манчини, иммуноферментный анализ (ИФА). Чувствительность ИФА тест-систем составила: для α1-ТС–глобулина мозга 5 нг/мл, для α2-КС-глобулина мозга – 10 нг/мл; ИДА тест-систем – 2 мг/л и 5 мг/л соответственно. Всего было протестировано 238 сывороток крови и образцов экстрактов фетальных, дефинитивных и опухолевых тканей мозга.

Статистическую обработку клинического и лабораторного материала проводили методами, принятыми в вариационной статистике, с вычислением средних величин и их ошибок (М ± m). За достоверные различия в сравнении средних величин в парных сравнениях брали t-критерий Стьюдента при р<0,05. Статистический анализ результатов исследования проведен с использованием лицензионной программы Excel-2003 (Microsoft).

Результаты исследований

При изучении экстрактов фетального мозга установлено, что оба нейроспецифических антигена — и α1-ТС–глобулин, и α2-КС-глобулин — методом иммуноферментного анализа обнаруживаются в ткани мозга плода начиная с 9–12 недель внутриутробного развития в концентрации 3000–5000 мкг/мл, и к третьему триместру беременности концентрация НМС приближается к уровням НСБ, зафиксированным в мозге взрослого.

Средние концентрации обоих НСБ в экстрактах дефинитивного мозга были приблизительно равны и составили 5940±1292 нг/мл для α1-ТС-глобулина и 6150±1583 нг/мл для α2-КС-глобулина мозга (табл. 1).

Следует отметить, что термостабильный α1-ТС-глобулин мозга обладает высокой антигенной потенцией. Это выражается в том, что антисыворотки к термически обработанным экстрактам мозга человека преципитируют иммунохимически идентичный антиген из состава ауто- и гомологичных экстрактов мозга кролика – продуцента антител.

Таблица 1

Результаты иммунохимического определения α1-ТС– и α2-КС-глобулинов мозга в составе экстрактов опухолей головного мозга человека

Исследуемые образцы тканей

Число наблюдений

Нейроспецифические белки (нг/мл)

α1-ТС–глобулин

α2-КС-глобулин

1. Нейроэктодермальные:

34

 

 

Анаплазия I степени

15

5830±1665

2250±861*

Анаплазия II–III степени

19

6320±1343

2630±929

2. Мезенхимальные:

24

 

 

арахноидэндотелиома

18

2360±769*

1840±630*

саркома

6

3750±968

1670±323*

Дефинитивный мозг

48

5940±1292

6150±1583

Примечание: * – достоверные значения по сравнению с экстрактом дефинитивного мозга (p<0,05).

 

Кислотостабильный α2-КС-глобулин, кроме мозга, обнаруживается в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) плодов 16–24 недель гестации. Характерно, что этот антиген обнаруживается в составе экстрактов некоторых аденокарцином яичника и ЖКТ.

Моноспецифические тест-системы на оба НСБ были использованы для характеристики антигенного состава опухолей головного мозга различного гистогенеза и степени злокачественности (табл. 1). Полученные данные указывают на достоверное снижение в некоторых опухолях содержания НСБ и позволяют заключить, что в отношении этих нейроспецифических антигенов наблюдаются процессы антигенного упрощения.

Данный феномен в большей степени обусловлен α2-КС-глобулином мозга, уровни которого снижаются и при нейроэктодермальных, и при мезенхимальных опухолях. Достоверное снижение α1-ТС-глобулина мозга характерно только для опухолей мозга мезенхимального происхождения (рисунок).

В связи с участием некоторых известных НСБ в феномене, которое носит название «антигенная дивергенция опухолевой ткани», мы протестировали содержание α1-ТС- и α2-КС-глобулинов мозга в экстрактах немозговых опухолей. В частности, хорошо известен факт синтеза такого НСБ, как нейрон-специфическая енолаза (NSE), опухолевой тканью легкого, поэтому иммуноферментный анализ онкомаркера NSE в сыворотке крови больных злокачественными опухолями легкого имеет высокую диагностическую ценность [2]. В настоящее время этот иммуноферментный тест применяется для мониторинга течения заболевания и контроля эффективности проводимой терапии и является обязательным при дифференциальной диагностике мелкоклеточного рака легких.

Концентрация α1-ТС- и α2-КС-глобулинов мозга в экстрактах опухолей мозга нейроэктодермального и мезенхимального генеза

На основании результатов иммуноферментного анализа НСБ при нейроэктодермальных и мезенхимальных опухолях головного мозга в качестве положительного теста на НСБ при немозговых опухолях считали референтную величину в 1000 нг/мл. При такой чувствительности теста наиболее часто НСБ выявляли аденокарциному яичника (табл. 2).

Таблица 2

Результаты иммунохимического исследования α1-ТС– и α2-КС-глобулинов мозга в гетерологических опухолях

Исследуемые образцы тканей

Число наблюдений

Нейроспецифические белки

α1-ТС–глобулин

α2-КС-глобулин

1. Аденокарцинома яичника

15

1

6

2. Псевдомуцинозная кистома яичника

9

3. Тератома яичника

6

2

1

4. Гепатоцеллюлярный рак

9

3

5. Опухоль почки

8

1

4

6. Аденокарцинома желудка

8

4

7. Аденома простаты

12

2

8. Мелкоклеточный рак легкого

5

1

Как следует из таблицы 2, в качестве дивергирующего антигена мозга чаще выступает кислотостабильный α2-КС-глобулин. Это особенно характерно для аденокарциномы яичника (частота положительных результатов, превышающих 1000 нг/мл, составила 40%), аденокарциномы желудка (50%), опухолей почки (50%) и печени (30%).

Напротив, термостабильный α1-ТС-глобулин мозга проявил себя как дивергирующий антиген только в отношении тератомы яичника (2 положительных случая из 6).

Методом ИФА нами проанализированы сыворотки крови больных с опухолевыми заболеваниями головного мозга (табл. 3). Термостабильный α1-ТС-глобулин мозга в наиболее высокой концентрации (1235±256,3 нг/мл) выявлен у пациентов с арахноидэндотелиомой, достоверно (p<0,05) превышающей значения не только в контрольной группе доноров (208±45,4 нг/мл), но и у пациентов с немезенхиальными опухолями (565±141,4 нг/мл). Полученные данные позволяют предполагать, что тест на α1-ТС-глобулин мозга в сыворотке крови больных с мезенхиальными опухолями может иметь дифференциально-диагностическое значение в неврологии и нейрохирургии. Уровни кислотостабильного α2-КС-глобулинов мозга в сыворотках крови пациентов с опухолевыми заболеваниями головного мозга ни в одной группе достоверно от донорских значений не отличались (95±28,8 нг/мл).

Таблица 3

Уровни нейроспецифических α1-ТС- и α2-КС-глобулинов в сыворотке крови больных с опухолевыми заболеваниями головного мозга

Исследуемые образцы тканей

Число наблюдений

Нейроспецифические белки (нг/мл)

α1-ТС–глобулин

α2-КС-глобулин

1. Нейроэктодермальные:

     

Анаплазия I степени

20

448±128,1

110±43,6

Анаплазия II–III степени

9

565±141,4*

94±39,2

2. Мезенхимальные:

     

арахноидэндотелиома

28

1235±256,3*

77±30,5

саркома

8

1406±363,0*

111±45,3

3. Эпителиальные:

     

аденома гипофиза

15

283±92,2

61±21,1

краниофарингиома

3

607±156,7*

84±20,4

Примечание: * – достоверные значения по сравнению с донорами (p<0,05).

Заключение

Обнаруженные новые органоспецифические альфа-глобулины мозга могут представлять теоретический интерес для нейрохимии и иметь клиническое значение в диагностике опухолевой патологии мозга.

Установлено, что оба нейроспецифических антигена – и α1-ТС–глобулин, и α2-КС-глобулин — методом иммуноферментного анализа с чувствительностью тест-систем для α1-ТС–глобулина мозга 5 нг/мл и для α2-КС-глобулина мозга 10 нг/мл обнаруживаются в ткани мозга плода начиная с 9–12 недель внутриутробного развития, и к третьему триместру беременности концентрация НМС приближается к уровням НСБ, зафиксированным в мозге взрослого.

Средние концентрации обоих НСБ в экстрактах дефинитивного мозга были приблизительно равны и составили 5940±1292 нг/мл для α1-ТС-глобулина и 6150±1583 нг/мл для α2-КС-глобулина мозга.

В экстрактах опухолевых тканей мозга обнаружено достоверное снижение содержания альфа-глобулинов мозга. Это означает, что в отношении этих нейроспецифических антигенов в опухолях мозга наблюдаются процессы антигенного упрощения.

Изучено содержание α1-ТС- и α2-КС-глобулинов мозга в экстрактах немозговых опухолей и установлено, что в качестве дивергирующего антигена мозга чаще выступает кислотостабильный α2-КС-глобулин.

Методом ИФА исследованы уровни α1-ТС- и α2-КС-глобулинов мозга в сыворотке крови больных с опухолевыми заболеваниями головного мозга. Полученные данные позволяют предполагать, что тест на α1-ТС-глобулин мозга в сыворотке крови больных с мезенхиальными опухолями может иметь дифференциально-диагностическое значение в неврологии и нейрохирургии.