Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

APPLICATION OF HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAFY (HPLC) METHOD IN ASSESSMENT OF ASCORBIC ACID IN PLANTS OF TARAXACUM OFFICINALE WEB., GROWING IN VARIOUS ECOLOGICAL CONDITIONS IN KEMEROVO REGION

Neverova O.A. 1 Egorova I.N. 2
1 Kemerovo State University
2 Institute of Human Ecology Federal State Budget Scientific Institution «The Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences»
Проведена оценка содержания аскорбиновой кислоты методом ВЭЖХ в листьях и корнях Taraxacum officinale Web., произрастающего в различных экологических условиях на территории Кемеровской области – на рекультивированных отвалах разреза «Кедровский» и в условно-чистой зоне. В ходе подбора условий экстракции аскорбиновой кислоты из сырья одуванчика лекарственного установлено, что ее оптимальный выход достигается при измельчении сырья до частиц размером не более 2 мм и использовании в качестве экстрагента 70 % этиловый спирт (1:50), время экстракции 1ч. 30 мин. Анализ показал, что содержание аскорбиновой кислоты в сырье, собранном на отвалах разреза «Кедровский», колеблется в пределах: в листьях от 123,0 до 185,0 мг %; в корнях от 27,0 до 43,0 мг %. Содержание аскорбиновой кислоты в сырье условно-чистой зоны находится в пределах: в листьях от 163,0 до 228,0 мг %; в корнях от 47,0 до 57,0 мг %. Установлено, что максимальное накопление витамина С в листьях одуванчика, на обоих участках приходится на сентябрь месяц. В августе месяце отмечено самое низкое его содержание – от 123,0 до 163,0 мг %. Результаты количественного анализа аскорбиновой кислоты позволяют рекомендовать к использованию сырья Taraxacum officinale Web. В качестве витаминного и антиоксидантного средства.
The assessment of ascorbic acid in leaves and roots of Taraxacum officinale Web., growing in various ecological conditions in Kemerovo region was studied – in reclaimed dump section “Kedrovskij” and in conditionally clean zone. We have studied that the optimum yields of extraction ascorbic acid from plants of Taraxacum officinale Web. was achieved by following conditions: herbs pulverization to fraction size not more than 2mm, as extractant using 70 % ethyl alcohol (1:50), extraction time 1h. 30min. Analysis showed that the content of ascorbic acid in herbs, collected from mine dump of coal mine “Kedrovskij” varies: in leaves from 123.0 to 185.0 mg%; in roots from 27.0 to 43.0 mg %. The content of ascorbic acid in herbs, collected in conditionally clean zone ranges: in leaves from 163.0 to 228.0 mg%; in roots from 47.0 to 57.0 mg%. It was studied, that the maximum accumulation of Vitamin C in leaves of Taraxacum officinale Web., in two areas, account for September. The lowest accumulation of Vitamin C – from 123.0 to 163.0 was observed in August. The results of quantitative analysis of ascorbic acid allow to recommend in use the herb of Taraxacum oficcinale Web. as a vitamin and antioxidant agent.
herb
taraxacum officinale web
ascorbic acid
high-performance liquid chromatography (hplc) method
extraction

В Кемеровской области одно из ведущих мест в секторе экономики занимает угольная промышленность, в структуре которой приоритетным направлением является добыча угля открытым способом. Площадь нарушенных земель в результате угледобычи составляет более 100 тыс. га, за последние годы было рекультивировано около 20 тыс. га, при этом наряду с биологической рекультивацией идет процесс естественного зарастания нарушенных земель. На 30–35-летних отвалах сформированы и устойчиво функционируют фитоценозы, в составе которых высока доля лекарственных растений.

Одним из первых на породных отвалах угольных разрезов поселяется и занимает большие территории одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Web.) – многолетнее травянистое растение семейства астровых (Asteraceae), растет на разных типах отвалов, в составе разнообразных сообществ [6].

В практической медицине применяется корень одуванчика, содержащий в своем составе полисахариды (инулин), тритерпеновые соединения, стеролы (тараксерол, тараксол, стигмастерин), флавоноиды, жирное масло и т.д. Листья одуванчика используются в народной медицине как противоцинготное и антиоксидантное средство. В последние годы ученые обратили внимание на надземные органы Taraxacum officinale Web., которые широко используются в народной медицине как у нас в стране, так и за рубежом [5,13].

Имеющиеся в литературе данные по количественному содержанию аскорбиновой кислоты в одуванчике лекарственном достаточно противоречивы, отсутствуют пределы их колебания в зависимости от фаз вегетации и мест произрастания [1,2,12].

Информация о содержании аскорбиновой кислоты в Taraxacum officinale Web., произрастающем в различных экологических зонах Кемеровской области отсутствует.

Цель и методика исследований

Целью представленной работы являлось изучение динамики содержания аскорбиновой кислоты методом ВЭЖХ в листьях и корнях одуванчика лекарственного, произрастающего в различных экологических условиях Кузбасса – на рекультивированных отвалах разреза «Кедровский» и в условно-чистой зоне.

Исследования проведены на породном отвале «Южный» ОАО разреза «Кедровский». Возраст отвала 30–35 лет. Отвал имеет равнинно-наклонный рельеф с высотой 58 м, площадь составляет 599.3 га. Возраст отвала 30–35 лет, в 2004 г. проведен комплекс работ по его планировке. Породы отвала представлены песчаником (60 %), алевролитами (20 %), аргиллитами (15 %), суглинками и глинами (5 %). [14]. Отвал характеризуется сформированными фитоценозами за счет естественного самозарастания и комплекса работ по биологической рекультивации.

Исследования сосредоточены на двух участках, различающихся экологическими условиями – опытный участок № 1 – на отвале «Южный» угольного разреза «Кедровский» и участок № 2 – в условно-чистой зоне, расположенной в 10 км северо-восточного направления от породных отвалов.

Опытный участок (№ 1) расположен в северной части отвала «Южный». Из древесных растений на участке растут Pinus sylbestris L. , Betula pendula Roth., Crataegus sanguinaea Pall., Populus nigra L., Hippophae rhamnoides L., Viburnum opulus L., Populus tremula L., Salix caprea L, Salix fragilis L, травянистая растительность представлена Taraxacum officinale Web. , Plantago major L., Fragaria vesca L. , Urtica dioica L. Potentilla argentea L., Melilotus officinalis (L.) Pall., Tussilago farfara L. и др. [3].

Почвы контрольного участка (№ 2) представлены черноземно-луговым среднемощным тяжелым суглинком. В разрезе имеет выраженную зернистую структуру с невысокой водопрочностью. Характеризуются в основном тяжелым гранулометрическим составом. Кислотность меняется от слабокислой в верхних горизонтах и почти нейтральной в нижних (рН водной вытяжки 3.13-6.1), Данная почва отличается высокой обеспеченностью гумусом (9.65 %), сравнительно значительным содержанием фосфора (63.0–83.0 мг/кг) и калия (40.0- 171.0 мг/кг) [10]. Фитоценозы представлены злаково-разнотравным лугом на границе березового леса.

Объектами исследования служили образцы высушенных листьев и корней Taraxacum offіcіnale Web., собранных с мая по сентябрь 2013 г. Заготовку сырья проводили в сухую солнечную погоду, согласно общепринятым правилам.

По ГФ Х1 издания количественное определение аскорбиновой кислоты в растительном сырье проводят методом титрования 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (ГФХ1). Однако возникающая неустойчивая окраска оттитрованного раствора, за счет использования данного реактива, приводит к получению недостаточно точно воспроизводимых результатов, что отмечают многие исследователи [7,9].

В настоящее время для определения аскорбиновой кислоты в растительном сырье используют различные физико-химические методы (фотоколориметрические, экстракционно-фотометрические и др.). Однако доказано, что наиболее чувствительным и точным методом является метод ВЭЖХ [7,9]. Прежде всего, это связано с высокой эффективностью разделения веществ, благоприятными условиями проведения анализа.

Определение аскорбиновой кислоты проводили методом ВЭЖХ с использованием хроматографа «Милихром А-02». Экстракты анализировали в градиентном режиме с подвижной фазой: А – ацетонитрил и В – перхлорат лития с рН 2,3 при скорости потока 8мкл/мин, температуре 38 ºС и УФ-детекции при 240 нм (рис.1). Время регистрации – 9 мин, поток 200 мкл/мин.

В качестве внешнего стандарта при определении использован рабочий стандартный образец (РСО) аскорбиновой кислоты. При хроматографировании в вышеуказанных условиях время удерживания (в мин) составило 0,89. Сбор и обработка хроматограмм осуществлялась с помощью программ WindowsMe/200/XP ®, МилиХром А-02®, МультиХром®.

 А

 Б

Рис.1. ВЭЖХ–хроматограмм спиртовых извлечений: А – из листьев одуванчика лекарственного; Б – из корней одуванчика лекарственного

В ходе подбора условий экстракции аскорбиновой кислоты из листьев и корней одуванчика лекарственного установлено, что ее оптимальный выход достигается при измельчении сырья до частиц размером не более 2 мм и использовании в качестве экстрагента 70 % этиловый спирт (1:50), время экстракции 1ч. 30 мин. Масса навески до 2 г (точная навеска).

Содержание аскорбиновой кислоты рассчитывали по площадям пиков на хроматограммах испытуемых растворов.

Результаты и их обсуждение

Метрологические характеристики методики количественного определения аскорбиновой кислоты в листьях и корнях одуванчика лекарственного представлены в табл. 1.

Таблица 1

Метрологическая характеристика количественного определения аскорбиновой кислоты в листьях и корнях Taraxacum officinale Web. методом ВЭЖХ

Сырье

Участок

F

¯X,мг %

S¯x

P,%

T(p,f)

?¯x

ε,%

листья

№ 1

4

127,0

1,113

95

2,78

4,788

±4,04

листья

№ 2

4

227,0

0,764

95

2,78

3,284

±4,47

корни

№ 1

4

27,30

0,310

95

2,78

1,334

±4,88

корни

№ 2

4

47,33

0,333

95

2,78

1,433

±3,03

Согласно результатам статистической обработки проведенных опытов, ошибка единичного определения аскорбиновой кислоты в листьях и корнях одуванчика лекарственного с доверительной вероятностью 95 % не превышала ±4,88 % (табл.1).

Результаты количественного определения аскорбиновой кислоты в листьях и корнях одуванчика приведены в таблице 2.

Таблица 2

Содержание аскорбиновой кислоты в листьях и корнях Taraxacum officinale Web.

 

Месяц

Содержание аскорбиновой кислоты, мг %

в листьях

в корнях

Участок №1

Участок № 2

Участок №1

Участок № 2

май

127,0

227,0

27,0

47,0

июнь

158,0

207,0

41,0

57,0

июль

153,0

165,0

43,0

50,0

август

123,0

163,0

32,0

53,0

сентябрь

185,0

228,0

40,0

51,0

 

Анализ образцов листьев и корней одуванчика лекарственного с использованием данной методики показал, что содержание аскорбиновой кислоты в сырье, собранном на опытном участке (№ 1), колеблется в пределах: в листьях от 123,0 до 185,0 мг %; в корнях от 27,0 до 43,0 мг % (табл.2).

Содержание аскорбиновой кислоты в сырье на контрольном участке (№ 2) находится в пределах: в листьях от 163,0 до 228,0 мг %; в корнях от 47,0 до 57,0 мг % (табл.2).

Из данных таблицы 2 видно, что максимальное накопление витамина С в листьях одуванчика, как на участке № 1, так и на участке № 2 приходится на сентябрь месяц. В августе месяце отмечено самое низкое его содержание – от 123,0 до 163,0 мг % (рис.2).

Рис. 2. Динамика содержания аскорбиновой кислоты в листьях Taraxacum officinale Web. в период вегетации на контрольном (№ 1) и опытном (№ 2) участках

Кроме того, установлено, что содержание аскорбиновой кислоты в лекарственном сырье (корнях) Taraxacum officinale Web. с участка № 1(контроль) ниже, чем с участка № 2 (опыт) (рис. 3).

Рис.3. Динамика содержания аскорбиновой кислоты в корнях Taraxacum officinale Web. в период вегетации на контрольном (№ 1) и опытном (№ 2) участках

Это подтверждает тот факт, что на содержание аскорбиновой кислоты могут оказывать влияние различные факторы внешней среды – погодные условия, освещенность, состав почвы, возраст растения, содержание микроэлементов и т.д. [4]. Поэтому на открытом, хорошо освещенном месте накопление аскорбиновой кислоты идет более интенсивно. При сборе сырья необходимо учитывать данный факт.

Количественное содержание аскорбиновой кислоты в корнях одуванчика примерно в 3–4 раза меньше, чем в листьях (табл.2).

Так в сравнении с листьями крапивы, где содержание витамина С для региона Сибири составляет по данным Лупинской и др. (2010) 185,3 мг %, по Скалозубовой (2013) – 33,64 мг %; с листьями земляники лесной -205,9 – 465,7 мг % [6,9]; с листьями черной смородины – 250,0 мг % [9]; высоковитаминным сырьем шиповника, для которого ГФ Х1 издания требует, чтобы содержание аскорбиновой кислоты было не менее 200 мг %, в листьях одуванчика содержание витамина С, с весны по осень, колеблется от 123,0 до 225,0 мг %.

Таким образом, полученные результаты позволяют предложить использовать листья Taraxacum officinale Web, произрастающего на территории Кузбасса как витаминное и антиоксидантное средство.

Заключение

Впервые проведен сравнительный анализ содержания аскорбиновой кислоты методом ВЭЖХ в листьях и корнях Taraxacum officinale Web., произрастающего на территориях с различной антропогенной нагрузкой, и установлено ее количественное содержание. Экспериментально показана высокая чувствительность метода ВЭЖХ в определении содержания аскорбиновой кислоты в растительных объектах.

Исследования сезонной динамики накопления аскорбиновой кислоты в листьях и корнях Taraxacum officinale Web. свидетельствуют о том, что накопление в них витамина С является динамическим процессом, зависящим от многих факторов внешней среды. В условиях породных отвалов содержание витамина С ниже, как в листьях, так и в корнях Taraxacum officinale Web. в сравнении с контрольным участком.

Полученные данные по содержанию аскорбиновой кислоты в листьях Taraxacum officinale Web., произрастающего на территории Кемеровской области, свидетельствуют о возможности использования данного вида сырья не только традиционно в качестве горечи, но и как источника витамина С, обладающего широкой фармакологической активностью.

Учитывая широкое распространение Taraxacum officinale Web. в сформированных фитоценозах возрастных породных отвалов угольных разрезов, необходимы дальнейшие исследования, связанные с подтверждением безопасности сырья для здоровья людей.