Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

THE SPECIES DIVERSITY HUMAN COLON SYMBIOTIC MICROBIOTA ANALYSIS AND DYSBIOSIS PREVENT WITH GROUP "LB-COMPLEX" PROBIOTICS

Tochilina A.G. 1 Belova I.V. 1 Soloveva I.V. 1 Zhirnov V.A. 1 Ivanova T.P. 1 Martyukhina O.K. 2 Chikina N.A. 2
1 Federal Budget Institution of Science «Nizhny Novgorod Scientific and Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after academician I.N. Blochina» Of Federal Service on Surveillance for Consumer Rights Protection and Human Welfare
2 Children's city clinical hospital №27
В статье представлены результаты изучения особенностей формирования микрофлоры детей первого года жизни, доказано, что дисбиоз кишечника и репродуктивного тракта беременных женщин являются факторами пренатального риска. Установлено, что в 94% дети рождаются с бактериальной флорой ЖКТ, причем в первые 24 часа жизни преобладают микроорганизмы родов Lactobacillus и Lactococcus, а также бактерии родов Staphylococcus и Escherichia. Показано, что другие условно-патогенные микроорганизмы присутствуют в микрофлоре здоровых новорожденных в 8,1% случаев. Далее происходит нарастание количества лактобацилл, лактококков и бифидобактерий, а также кишечных палочек, энтерококков и других УПМ. Установлено, что с наибольшей частотой – в 92% случаев – УПМ в значимых количествах выделяются в группе здоровых детей в возрасте от 1 месяца до 1 года. Показана эффективность включения авторских пробиотиков группы «LB-КОМПЛЕКС» в диетотерапию беременных для профилактики формирования ранних дисбиотических состояний у новорожденных, а также в комплексные программы выхаживания недоношенных новорожденных и детей с гастроэнтерологической патологией, осложненной дисбиозом ЖКТ с преимущественным выделением грибов рода Candida.
This article presents the results of study of features specific to infant microflora formation. It is proved that dysbiosis of the intestinal and reproductive tract of pregnant women are prenatal risk factors. It is found that 94% of children are born with bacterial flora in the gastrointestinal tract; moreover in the first 24 hours of life, the predominant are Lactobacillus and Lactococcus microorganisms and Staphylococcus and Escherichia. It has been shown that other opportunistic microorganisms are present in microflora of healthy infants in 8.1% cases. Further there is a rise in the number of Lactobacillus, Lactococcus and Bifidobacterium as well as E. coli, enterococci and other opportunistic microorganisms. It was found that most often - in 92% cases - significant quantities of opportunistic microorganisms are detected in the group of healthy children aged from 1 month to 1 year. The effectiveness of inclusion of «LB-COMPLEX» group patented probiotics - as a diet therapy - in programs of complex treatment of children with various diseases of nosological entity complicated by dysbiosis, has been proved.
microorganisms
ontogenesis
intestinal microflora of the child
large intestine
age groups

Важным и определяющим звеном в процессе формирования микробиоценоза является первичная колонизация бактериями новорожденного, так как в дальнейшем состояние здоровья индивидуума и резистентность к целому ряду заболеваний во многом зависят от характера кишечной микрофлоры и ее активности.

До недавнего времени считалось, что формирование микробиоценоза начинается в момент рождения и обусловлено видовым составом микрофлоры родовых путей матери. Однако с конца 80-х годов прошлого века в зарубежной литературе стали появляться работы, демонстрирующие контакт микрофлоры матери с плодом in utero. Открытие отечественными учеными [10] «феномена бактериальной транслокации» еще в большей степени подвергло сомнению убеждение о стерильности желудочно-кишечного тракта плода. В работе И.А. Бочкова [5] была установлена идентичность кишечных штаммов новорожденного и материнской микрофлоры. Эти факты свидетельствуют в пользу того, что внутриутробно развивающийся плод не является стерильным, а получает от матери какое-то количество индигенных микроорганизмов.

При проведении совместных исследований с ФГБУ «Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии» было выявлено, что среди беременных с дисбиозом кишечника 70% имели отклонение в течении беременности, родов и послеродового периода. У 50% детей, родившихся от них, отмечались отклонения в состоянии здоровья, причем процент их увеличивался до 78% в зависимости от выраженности изменений и состава биоценоза [7].

В связи с этим следует осознавать важность состояния здоровья матери, параметров биоценоза ее кишечника и родовых путей, поскольку она является первичным источником колонизации, а в ряде случаев и инфицирования ребенка [11].

Цель исследования: установить особенности формирования микрофлоры кишечника человека в онтогенезе, подтвердить зависимость между состоянием микробиоты беременной женщины и состоянием новорожденного, а также разработать тактику коррекции нарушений микрофлоры кишечника с использованием авторских пробиотиков группы «LB-комплекс».

Материалы и методы исследования. Было проведено исследование микрофлоры просвета толстой кишки 3268 «здоровых» и «больных» людей различных возрастных групп. Группы людей были сформированы по критериям здоровья, определенным для каждой возрастной группы в отдельности. Проверка данных на нормальность распределения проводилась с применением статистических критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Для статистической обработки полученных результатов использовались непараметрические критерии Mann - Whitney и Kruskal - Wallis [1]. Многомерный кластерный анализ данных проведен методом Варда, результаты кластеризации проанализированы с помощью метода К-средних, критический уровень значимости р принимался за 0,05. В случае множественных сравнений производилась корректировка критического уровня значимости с помощью поправки [1].

Изучение микрофлоры толстой кишки проводилось по методу, разработанному Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанской и модифицированному в Нижегородском НИИЭМ [8].

Результаты исследования и их обсуждение

Группы «здоровых» детей были сформированы по критериям здоровья, определенным для каждой возрастной группы в отдельности: «здоровые» (0-1 месяц) - дети, рожденные от здоровых матерей, в анамнезе не имеющих вредных привычек, хронических соматических и инфекционных заболеваний, анемий, болезней мочеполовой системы (в том числе кольпитов), без отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза (инфекционных осложнений при предыдущих беременностях, привычного невынашивания и т.п.), родоразрешившихся естественным путем, без кровотечений в послеродовом периоде, не получавших антибактериальную терапию в течение всего периода беременности, в родах и послеродовом периоде.

Дети доношенные, рожденные в срок, весом от 2,6 до 4,0 кг, ростом от 46 до 54 см, оценка по шкале Апгар 8-10 баллов, без врожденных аномалий развития, не испытывавшие хроническую внутриутробную гипоксию, асфиксию в родах, не получившие травм в родах, не имевшие синдрома дыхательных расстройств, не получающие антибактериальную терапию, находящиеся на естественном или смешанном вскармливании.

Материал на исследование отбирался в период санитарно-эпидемиологического благополучия в родильных домах.

Другие группы «здоровых» детей (старше 1 месяца) были отобраны соответственно принятым нормативам детского возраста [6]. Это дети, получавшие прикорм согласно возрастным нормам [4], не имевшие на момент обследования проявлений каких-либо заболеваний, в том числе респираторных, и в течение 2 месяцев до обследования не принимавшие антибиотики.

К группе «больных» детей (0-1 месяц) были отнесены доношенные дети без врожденных уродств и выраженной патологии, отнесенные к подгруппе риска по развитию гнойно-воспалительных заболеваний по клиническим показателям состояния здоровья новорожденного по шкале Апгар (менее 8 баллов) и факторам пренатального риска у матери.

Группы «больных» в возрасте от 1 месяца и более были сформированы по следующим критериям: «больные» – пациенты, в анамнезе которых на момент обследования отмечались хронические заболевания в стадии обострения или клинические проявления острой формы, на фоне применения антибактериальных и/или других лекарственных средств, так и при первичном обращении до назначения этиотропной терапии, а также все не вошедшие в группу «здоровые».

Обобщив данные, полученные по каждой возрастной группе, можно представить процесс формирования микрофлоры у здоровых и больных людей в течение жизни (рис. 1).

Рис. 1. Характеристика численности аэробной и анаэробной симбионтной микрофлоры толстой кишки «здоровых» (А) и «больных» (Б) людей разных возрастных групп (количество микроорганизмов приведено в усредненных значениях)

На рисунке видно, что в первые сутки жизни в процессе формирования микрофлоры кишечника как у здоровых, так и у больных младенцев участвуют как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы, причем в равных соотношениях с первого часа жизни, процесс нарастания анаэробной компоненты (представители родов Lactobacillus, Lactococcus и Bifidobacterium) идет параллельно с ростом условно-патогенных микроорганизмов, E.coli и бактерий рода Enterococcus до уровня 105-107 КОЕ/мл.

Начиная с шестых суток жизни у детей обеих групп анаэробная флора начинает преобладать. Но у здоровых детей она выделяется в количестве 109-1010 КОЕ/мл, а у больных - 106-107КОЕ/мл, причем если преобладание количества лакто- и бифидобактерий над УПМ и кишечной палочкой у здоровых детей идет на 2-3 порядка, то у больных детей эта разница наблюдается в пределах одного порядка.

Также было отмечено, что общее количество микроорганизмов, выделяемых из просвета толстой кишки «больных» людей, на два порядка ниже, чем у «здоровых». В пожилом и старческом возрасте таких различий не обнаруживается (группа 60 лет и более) (рис. 2).

Рис. 2. Частота выделения представителей кишечной микрофлоры и УПМ из кишечника «здоровых» (А) и «больных» (Б) людей разных возрастных групп

Проанализировав данные о частоте встречаемости отдельных представителей микробиоценоза просвета толстой кишки в микрофлоре «здоровых» людей различных возрастных групп, следует отметить, что в 94% дети рождаются с бактериальной флорой ЖКТ, причем в первые 24 часа жизни преобладающей флорой являются микроаэрофильные микроорганизмы родов Lactobacillus и Lactococcus, а также факультативно-анаэробные микроорганизмы родов Staphylococcus и Escherichia. Условно-патогенные микроорганизмы уже присутствуют в микрофлоре здоровых новорожденных в 8,1% случаев. Далее во время пребывания в родильном доме (1-7 сутки) и в домашних условиях (от 7 суток до 1 года) происходит нарастание количества как лакто-, лактококков и бифидобактерий, так и E.coli, энтерококков, УПМ. Установлено, что с наибольшей частотой – в 92% случаев – УПМ в значимых количествах выделяются в группе здоровых детей в возрасте от 1 месяца до 1 года. Высокий уровень обсемененности условно-патогенной флорой можно объяснить тем, что этот период жизни ребенка отмечен самыми активными изменениями в структуре питания, развития организма и др. До года проходят все четыре стадии сукцессии: первая стадия - грудное вскармливание, вторая стадия - начало дачи прикорма, третья стадия - начало дачи твердой пищи, четвертая - отмена грудного вскармливания. В данном конкретном случае под сукцессией понимается изменение качественного и количественного состава микроорганизмов у детей в соответствии с изменениями факторов внешней среды: питания, режима, развития организма и др. и функционального состояния иммунной системы. Частота обнаружения УПМ в микрофлоре толстой кишки здорового человека начинает снижаться после первого года жизни и составляет 21,4% в возрастной группе 7-17 лет.

Проанализировав данные о частоте встречаемости отдельных представителей микробиоценоза просвета толстой кишки в микрофлоре «больных» людей различных возрастных групп, следует отметить, что у детей в возрасте до 1 года наблюдается резкое снижение частоты выделения представителей анаэробной части флоры (лактобацилл и бифидобактерий), а также условно-патогенных видов в значимых количествах (105 КОЕ/г и более) по сравнению с детьми из подгруппы «здоровых». Особенно это заметно в возрастных группах 7 с. – 29 с. и 1 мес. – 11 мес. (37 и 50%, 29,5 и 91,6% соответственно). В более старших возрастных группах частота обнаружения УПМ в группе «больных» достоверно выше, чем у «здоровых», частота выделения анаэробов снижена.

В ассоциациях УПМ выделялись чаще у «больных» детей, чем у «здоровых», во всех возрастных группах, кроме группы детей от 1 месяца до 1 года (рис. 3).

Рис. 3. Частота обнаружения ассоциаций УПМ у «здоровых» и «больных» людей разного возраста

Полученные результаты можно объяснить с точки зрения процесса формирования местной толерантности к резидентной микрофлоре и существующей теорией эндогенного инфицирования, описанных в трудах зарубежных и отечественных ученых, когда своя микрофлора воспринимаются организмом человека как чужеродная. В связи с этим возникновение патологического процесса можно объяснить не количеством выделяемых УПМ, а их измененными свойствами и подавлением лакто- и бифидобактерий [2].

Ввиду того что бактерии рода Lactobacillus и Bifidobacterium являются симбионтами кишечника человека с периода новорожденности, для восстановления нарушенной микроэкологии и иммунных реакций целесообразно использовать пробиотические препараты, содержащие именно этих представителей микрофлоры.

В настоящее время на рынке представлены как пробиотики в лиофильно высушенном виде, так и препараты в жидкой форме. Препараты в сухой форме имеют ряд положительных черт, например длительный срок годности, удобство хранения и реализации. Но процесс лиофилизации бактерий оказывает негативное влияние на структуру их поверхностных белков, активность адгезии, а также приводит к разрушению ценных бактериальных метаболитов. В сухих препаратах бактерии находятся в неактивном состоянии, для восстановления свойств необходим период времени от 8 до 10 часов, в то время как у младенцев и детей раннего возраста процесс пищеварения занимает 4-6 часов. Жидкая форма пробиотиков, напротив, способствует реализации положительных свойств штаммов-продуцентов в полной мере, так как бактерии находятся в активном физиологическом состоянии и способны эффективно колонизировать слизистую кишечника. Кроме того, в жидкой среде сохраняются все бактериальные метаболиты [3].

Основной недостаток жидких форм – короткий срок хранения, необходимость учета вкусовых характеристик и относительное неудобство применения. Тем не менее их преимущества вполне компенсируют перечисленные недостатки. На сегодняшний день на рынке представлено достаточное количество пробиотиков в жидкой форме: «Наринэ» (Армения), «Биовестин-лакто» (Россия, Новосибирск), «Нормофлорин Л» (Россия, Москва) и др.

В Нижегородском НИИЭМ им. академика И.Н Блохиной Роспотребнадзора разработана линия жидких пробиотиков «LB-комплекс». Это бактериальные концентраты, содержащие симбиотические штаммы лактобацилл видов L. plantarum, L. fermentum (пробиотик «LL-комплекс»), а также лактобацилл L. plantarum, L. fermentum и бифидобактерий видов B. bifidum, B. longum («LB-комплекс»). В качестве основы пробиотиков использован гидролизат молока, представляющий собой гипоаллергенный раствор аминокислот и простейших пептидов. Штаммы лактобацилл, входящие в состав БАД, обладают высоким уровнем β–галактозидазной активности, что позволяет использовать пробиотики при лактазной недостаточности. Штаммы-продуценты образуют устойчивую систему, обладающую высоким уровнем антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и высоким уровнем антибиотикорезистентности не трансмиссивного типа. В 1 мл пробиотиков содержится 109-1011 КОЕ/мл живых микробных клеток. Штаммы, входящие в их состав, всесторонне изучены и отвечают требованиям, регламентированным современными нормативными документами - МУК 4.2.2602.-10.4.2. и МУ 2.3.2.2789-10 [9].

Пробиотики группы «LB-комплекс» использовались в 22 лечебно-профилактических учреждениях в качестве пробиотической составляющей диетотерапии в программах комплексного лечения больных с различными нозологическими формами заболеваний, осложненных дисбиозом.

Пробиотик был использован в качестве диетотерапии в комплексном лечении акушерской и сопутствующей патологии 30 женщин (гестационный срок 28-30 недель), находящихся на стационарном лечении в отделении патологии беременных. Группу сравнения составили 30 женщин, получавших базовую терапию и плацебо. Основная группа и группа сравнения были сопоставимы по возрасту и форме патологии (акушерско-гинекологические нарушения в сочетании с сопутствующей патологией и дисбиозом кишечника и влагалища).

Эффективность включения «LB-комплекса» в диетотерапию беременных для профилактики формирования ранних дисбиотических состояний у новорожденных

 

Показатели

Частота выявления признака, %

Основная группа

Группа сравнения

женщины

Слабая родовая деятельность

8,4%

18,3%

Инфицирование околоплодных вод

0%

12,6%

Инфекция в родах

7,1%

17,8%

новорожденные

Гнойный конъюнктивит новорожденных

0%

11%

Клинические признаки ВУИ

0%

11%

Апгар 8-9

92%

73%

Апгар 7

8%

27%

Выписка из роддома клинически здоровыми

76%

54%

Установлено, что у родильниц основной группы отмечается более гладкое течение родов и послеродового периода, в то время как в группе сравнения слабость родовой деятельности наблюдалась в 18,3% случаев (в основной – в 8,4%); инфицирование околоплодных вод – в 12,6% случаев было только у рожениц этой группы. Также в группе сравнения в 2,5 раза чаще наблюдали инфекцию в родах и раннем послеродовом периоде (7,1% и 17,8% соответственно). Новорожденных наблюдали с момента рождения и в раннем неонатальном периоде. У 11% детей группы сравнения был диагностирован конъюнктивит, наблюдалась клиника внутриутробной инфекции (ВУИ). Клинически здоровыми из роддома вышли 76% новорожденных основной группы и только 54% из группы сравнения (таблица).

Таким образом, включение пробиотика «LB-комплекс» в диетотерапию при комплексной терапии акушерской патологии улучшает показатели здоровья матери и ребенка.

В отделении патологии новорожденных и недоношенных детей детской городской клинической больницы № 27 «Айболит» г. Нижнего Новгорода в течение 10 лет «LB-комплекс» включен в программу комплексного лечения и выхаживания недоношенных новорожденных (всего пробиотик получили 3 574 ребенка).

Ранее нами были проведены исследования, показывающие эффективность использования пробиотика: «LB-комплекс» получали дети, поступающие в отделение (30 детей) в течение всего срока пребывания в стационаре (от 20 до 45 дней). Для оценки эффективности была выделена группа сравнения, получавшая плацебо (30 детей).

У всех детей на момент поступления имелись нарушения процесса формирования микробиоты II и III степени. Микрофлора характеризовалась отсутствием или сниженным содержанием анаэробного компонента на фоне значительного обсеменения условно-патогенными микроорганизмами. После курса лечения пробиотиком в основной группе ни у одного ребенка не было выявлено нарушений формирования микрофлоры III степени, в то время как в группе сравнения у части детей продолжали выявляться выраженные нарушения в микробном пейзаже (рис. 4).

Рис. 4. Состояние микрофлоры кишечника недоношенных новорожденных при поступлении и после курса лечения: базовая терапия с плацебо и базовая терапия с пробиотиком «LB-комплекс»

У детей основной группы после лечения титр лакто- и бифидобактерий составил 108 – 1011 КОЕ/мл, в то время как в группе сравнения наблюдается их выраженное снижение (рис. 5).

Рис. 5. Количество бифидобактерий (А) и лактобацилл (Б) после курса лечения в основной группе и группе сравнения

Опыт использования «LB-комплекса» в отделении патологии новорожденных и недоношенных детей показал его выраженную клиническую эффективность: улучшалось общее состояние детей, повышалась двигательная активность, ежесуточная прибавка массы тела возросла с 10,0-20,0 до 30,0-40,0 г. За период введения пробиотика в комплексную терапию в отделении в два раза снизилось количество детей с гнойно-септическими проявлениями (конъюнктивит, пиодермия, отит), ни у одного ребенка не наблюдали диарейный синдром.

В последние годы в педиатрической практике увеличилась частота дисбиозов с избыточным ростом грибов рода Candida, причем у 10,4% больных выявляются признаки микогенной сенсибилизации. Реализация патологического процесса при неинвазивном кандидозе кишечника происходит за счет интенсивного размножения Candida spp. в просвете пищеварительной трубки, при этом индуцируется ступенчатое углубление дефицита облигатной микробиоты и присоединение микст-инфекции (при этом угнетается анаэробная флора на фоне выделения ассоциации УПМ). В гастроэнтерологическом отделении этого же стационара пробиотик был включен в диетотерапию при комплексном лечении детей с гастроэнтерологической патологией и атопическими дерматитами. Поскольку у 77,3% детей был выявлен дисбиоз, ассоциированный с C. albicans, в алгоритм лечения детей с данной патологией был включен авторский препарат «LL-комплекс» с антимикотической активностью. Были выделены: основная группа - 33 ребенка на фоне базовой терапии, получавшие «LL-комплекс» по 5 мл в сутки, и группа сравнения - 33 человека, на фоне базовой терапии получавших плацебо.

Необходимо отметить, что в данном случае часто встречались ассоциации грибов рода Candida с представителями семейства Enterobacteriaceae, Staphilococcaceae, Pseudomonadaceae, Bacillaceae (Clostridium spp.).

В результате проведенного исследования установлено, что после курса лечения в основной группе в 4,2 раза снизилась частота выделения C. albicans - с 77,3% (в количестве более 104 КОЕ/мл) до 54,5% (в количествах 102 и менее КОЕ/мл), тогда как в группе сравнения частота выделения грибов осталась на том же уровне (рис. 6).

Рис. 6. Частота выделения УПМ до лечения (А) и после курса проведенного лечения в основной и контрольной группах (Б)

Количество лакто- и бифидобактерий в основной группе по сравнению с контрольной значительно выросло (рис. 7).

Рис. 7. Количество бифидобактерий (А) и лактобацилл (Б) после курса лечения

Таким образом, в ходе работы подтверждена эффективность включения пробиотика «LL-комплекс» в алгоритм лечения детей с дисбиозами, ассоцированными с C. albicans.

Таким образом, в ходе работы установлены закономерности формирования микробиоты кишечника детей в онтогенезе. Показано, что в 94% дети рождаются с бактериальной флорой ЖКТ, причем в первые 24 часа жизни преобладающей флорой являются микроаэрофильные микроорганизмы родов Lactobacillus и Lactococcus, а также факультативно-анаэробные микроорганизмы родов Staphylococcus и Escherichia. Условно-патогенные микроорганизмы уже присутствуют в микрофлоре здоровых новорожденных в 8,1% случаев. Далее во время пребывания в родильном доме (1-7-е сутки) и в домашних условиях (от 7 суток до 1 года) происходит нарастание количества как лакто-, лактококков и бифидобактерий, так и E. coli, энтерококков, УПМ. Установлено, что с наибольшей частотой – в 92% случаев – УПМ в значимых количествах выделяются в группе здоровых детей в возрасте от 1 месяца до 1 года.

В результате проведенных исследований доказано, что наиболее рациональной и эффективной профилактикой нарушений формирования микрофлоры у новорожденных является своевременная профилактика и лечение дисбиоза влагалища и кишечника у женщин в период беременности.

Полученные результаты доказывают эффективность применения пробиотиков группы «LB-комплекс» в качестве средств коррекции дисбиоза кишечника.

Необходимо отметить важность грамотного включения пробиотиков в комплекс базовой терапии в качестве пробиотической составляющей диеты с учетом фармакокинетики применяющихся препаратов. Необходимо назначать пробиотики в промежутке между приемом антибактериальных средств и других химиопрепаратов, причем разница по времени должна быть не менее 2 часов.