Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

THE COMPOSITION OF LEAVES OF BIRCH (BETULA PENDULA ROTH.) PHENOLIC COMPOUNDS AT THE GYPSY MOTH (LYMANTRIA DISPAR L.) OUTBREAKS AND FOR THEIR BOUNDARIES

Koltunov E.V. 1 Yakovleva M.I. 1
1 Botanical Garden of Ural Branch RAS
Методом ВЭЖХ изучен состав и содержание фенольных соединений листьях березы повислой из затухших очагов непарного шелкопряда и за их границами. Хроматографический анализ выявил 75 фенольных соединений. При тотальном сравнительном анализе идентичных фракций в образцах за границами очагов выявлено преобладание фенольных соединений с заметным снижением содержания в пике (56 %), по сравнению с контролем. У 37,3 % фракций содержание возрастало, у 6,7 % изменений не наблюдалось. Сравнительный анализ идентифицированных фенольных соединений показал преобладание соединений, содержание которых возрастало (52,94 %). Выявлено повышение содержания таких фенолгликозидов, как арбутин и салицин, что можно рассматривать как аргумент в пользу наличия более высокого уровня конститутивной энтоморезистентности в насаждениях за границами очагов. Мы предполагаем, что результаты тотального анализа были обусловлены воздействием стресса (майской засухи) и более сильной реакцией древостоев в очагах на этот фактор, как установлено нами ранее. В целом же в древостоях с высокой энтоморезистентностью (вне очагов) всегда наблюдается более высокий уровень конститутивной резистентности.
By the method of HPLC composition and content of phenolic compounds from Betula pendula Roth. leaves from the gypsy moth outbreaks and beyond their boundaries is studied. Chromatographic analysis (HPLC) identified 75 of phenolic compounds. Comparative analysis in total identical fractions of the samples revealed outbreaks boundaries predominance phenolics content with a significant reduction in the peak (56 %), compared with the control. At 37.3 % increased content of fractions, from 6.7 % changes were not observed. Comparative analysis of the identified phenolic compounds showed the predominance of compounds, content of which is increased (52.94 %). Revealed increased content of phenolic glycosides as arbutin and salicin, which can be considered as an argument in favor of a higher level of constitutive entomoresistance in stands beyond the boundaries of outbreaks. We assume that the results of the total analysis was due to the influence of stress (May drought) and a stronger stands reaction in the outbreaks on this factor, as established earlier.As a whole in the stands with high entomoresistance (outside outbreaks) always higher levels of constitutive resistance is observed.
constitutive entomoresistance
chromatography
birch (Betula pendula Roth.)
outbreaks
Gypsy moth
phenolic compounds

Известно, что биохимический состав растений оказывает значительное влияние на степень предпочтения субстрата, их выживаемость и степень дефолиации крон древесных растений [5]. Вследствие этого параметры энтоморезистентности растений являются ключевыми, детерминирующими как возможность реализации вспышек массового размножения лесных насекомых-фитофагов, так и степень дефолиации крон и площади очагов [1]. Энтоморезистентность дифференцируется на конститутивную и индуцированную [9;12]. Конститутивная энтоморезистентность (природная) является генетически детерминируемой неповреждаемостью их насекомыми. На биохимическом уровне она обусловлена содержанием в хвое и листьях соединений, которые вызывают избегание и непредпочитаемость насекомыми этих растений [9;11]. Нередко они являются токсичными для насекомых (например: алкалоиды) [6]. Индуцированная энтоморезистентность активируется воздействием на растения различных экзогенных биотических и абиотических факторов [9;11]. При этом если биохимические аспекты механизмов индуцированной энтоморезистентности изучаются очень интенсивно [2; 3; 7; 9; 12; 13], то биохимические аспекты конститутивной энтоморезистентности изучены значительно меньше. Исходя из этого, биохимические аспекты конститутивной энтоморезистентности и были задачей данного исследования. Ранее этот вопрос нами изучался [4], но особенности сезонной динамики фенольных соединений (особенно фенолгликозидов, в значительной степени детерминирующих параметры энтоморезистентности у растений [10]) и количественные параметры изменения антиоксидантной активности не исследовались.

Материалы и методы

Для хроматографического анализа 20 мая был проведен сбор листьев березы повислой как из локальных затухших очаговмассового размножения непарного шелкопряда на пробных площадях с ежегодно регистрируемым процентом дефолиации крон, так и за границами очагов, где в течение 30 лет отсутствовала дефолиация. Взятие каждой пробы осуществлялось от нескольких деревьев. Затем пробы смешивались для получения средней пробы. Очаги массового размножения находились в Каменск-Уральском районе Свердловской области. Пробные площади располагались в березняках вблизи пос. Покровское. Контрольные пробы взяты в березняках вблизи пос. Храмцовское, растущих в сходных лесорастительных условиях.

Сразу после сбора листья березы высушивали при 60 °С, затем размалывали. Навеску с 2 г размолотых листьев смешивали с 20 мл 95 % этанола. Экстракцию фенольных соединений из листьев березы проводили в обратном холодильнике на водяной бане в течение 30 мин при кипении раствора. После этого суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Супернатант фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Хроматографический анализ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20 со спектрофотометрическим УФ-детектором. Детектирование элюента осуществляли одновременно на двух полосах поглощения: 254 и 360 нм на хроматографической колонке PerfectSil Target ODS-35мкм с обращенной фазой, размером 250 х 4,6 мм. Градиентное элюирование проводилось в диапазоне 10–50 % со скоростью 1 мл/мин при температуре 40 °С. Элюент А – ацетонитрил – 0,05 М фосфатный буферный раствор (рН=3,0); элюент В – ацетонитрил-вода (9:1). Продолжительность хроматографического анализа – 45 мин при 40 °С. Из них от 0 до 30 мин проводилось градиентное элюирование в диапазоне 10–50 %, затем в течение 15 мин при концентрации 50 %. Для идентификации фенольных соединений использовали вещества-свидетели фирм: Fluka, Sigma, Aldrich: апигенин, аскорбиновая к-та, арбутин, гиперозид, галловая к-та, гидрохинон, кверцетин, изокверцетин, изокверцитрин, кафтаровая к-та, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, рутин, феруловая к-та, 4-кофеоилхинная к-та, 5-кофеоилхинная к-та, кемпферол, мирицетин, салицин, салидрозид.

Результаты

Градиентный хроматографический анализ (ВЭЖХ) образцов из листьев березы повислой, взятых как в затухших очагах непарного шелкопряда, так и за их границами, выявил 75 фенольных соединения (рис. 1).

Рис. 1. ВЭЖХ фенольных соединений из листьев березы повислой в затухших очагах непарного шелкопряда

Из общего количества фракций нами идентифицировано 18 фенольных соединений. Список идентифицированных нами фенольных соединений в листьях березы представлен в таблице. По химическому составу это были флавоноиды, фенолгликозиды, фенолкарбоновые и гидроксикоричные кислоты.

Нами был проведен как тотальный сравнительный количественный попарный анализ основных, выявленных при хроматографии пиков, так и сравнительный анализ идентифицированных нами фенольных соединений (таблица, рис. 2).

Сравнительный анализ содержания идентифицированных фенольных соединений в листьях березы повислой в очагах непарного шелкопряда и за их границами

Очаг, пос. Покровское

За границами очагов,

пос. Храмцовское

Наименование соединения

ВУ

Абсорбция (Mv)

Υ360/

Υ254

ВУ

Абсорбция (Mv)

Υ360/

Υ254

Аскорбиновая к-та

2,63

46,078±5,28

0,03

2,62

58,559±6,11

0,015

Арбутин

2,83

81,23±9,37

0,054

2,83

102,252±12,38

0,085

Галловая к-та

3,05

100,28±14,71

0,028

3,12

246,85±22,52

0,0091

Кафтаровая к-та

4,0

16,526±2,012

0,044

3,92

14,685±1,36

0,098

Салицин

4,8

24,705±2,85

0,034

4,71

49,009±5,47

0,051

Салидрозид

6,43

345,098±41,18

0,016

6,32

259,909±29,89

0,014

4-кофеоилхинная к-та

6,81

8,627±0,97

0,195

6,81

5,405±0,62

0,258

Рутин

9,5

17,087±2,26

0,36

9,4

17,57±1,19

0,361

5-кофеоилхинная к-та

9,82

23,92±2,51

0,546

9,82

29,0±3,14

0,540

Гиперозид

11,5

33,52±3,82

0,70

11,55

29,819±3,35

0,504

Изокверцетин

11,91

237,43±27,18

0,948

11,83

128,83±13,18

0,879

Феруловая к-та

10.75

7,762±0,84

0.292

10.82

6.396±0,71

0.226

Изокверцитрин

12,35

91,899±10,14

0,784

12,28

95,495±10,14

0,651

Мирицетин

16,78

188,83±21,4

0,843

16,68

226,576±25,16

0,835

Лютеолин

23,6

12,01±1,51

0,814

23,61

5,586±069

0,795

Кверцетин

26,96

46,145±5,23

1,01

26,98

86,126±9,35

0,992

Апигенин

28,43

1,732±2,02

0,645

27,75

2,252±0,29

0,796

Кемпферол

29,7

3,408±0,41

1,139

29,68

4,594±0,52

1,275

Как показали результаты сравнительного анализа образцов листьев из очагов и контрольных древостоев (за границами очагов), они значительно отличались между собой (рис. 2). Так, за границами очагов у 37,3 % хроматографических пиков содержание фенольных соединений заметно возрастало, по сравнению с образцами из затухших очагов, у 56 % пиков содержание снижалось, у 5,97 % – не изменялось (рис. 2).

Сравнительный попарный анализ идентифицированных фенольных соединений продемонстрировал другие результаты. Так, за границами очагов у 52,94 % хроматографических пиков содержание фенольных соединений заметно возрастало, по сравнению с образцами из затухших очагов, у 35,29 % пиков содержание снижалось, у 11,76 % – не изменялось (рис. 2, таблица). Особенно большой интерес среди группы идентифицированных соединений представляют фенолгликозиды, так как известно, что они обладают антифидантными свойствами [6; 10].

Рис. 2. Соотношение фенольных соединений при тотальном попарном анализе пиков хроматограмм из листьев березы (1,2) за границами очагов (1,4), в затухших очагах (2,5) и идентифицированных фенольных соединений (4,5)

По вертикали: изменение содержания фенольных соединений в пробе (в %). Слева направо: 1 – возрастание, 2 – снижение, 3 – отсутствие изменений.

Сравнительный анализ содержания фенолгликозидов в листьях березы из затухших очагов и за их границами показал, что содержание арбутина в пробах, взятых вне очагов, возрастало на 25,88 %, салицина на 98,38 %, содержание салидрозида, наоборот, снижалось на 24,68 %, лютеолина – на 53,49 % (рис. 2).

Для более точного сравнительного анализа основных тенденций изменения содержания фенольных соединений в листьях березы в затухших очагах и за их границами нами во всех пробах были исключены минорные фракции. Как показали результаты, у 36,1 % фенольных соединений их содержание заметно возрастало, у 50 % – снижалось, у 13,88 % не изменялось.

Следовательно, основной тенденцией у мажорных фракций фенольных соединений за границами очагов было снижение содержания, хотя и количество соединений с заметным возрастанием концентрации также было высоким.

Сравнительный анализ содержания фенольных соединений с данными предыдущего исследования, пробы для которого были взяты позже, показал, что по абсолютному содержанию пробы, взятые позже (в июле-августе), содержали более высокое количество идентичных соединений. Это, в целом, совпадает с результатами ряда других исследований, показавших, что к концу сезона вегетации содержание ряда соединений в листьях возрастает к концу сезона вегетации [8].

В целом, как показали результаты исследований при сравнительном анализе как тотальных фракций фенольных соединений в листьях березы, так и идентифицированных, наблюдаются разнонаправленные процессы: как снижение содержания фенольных соединений в листьях березы за границами очагов, так и их возрастание. При этом у многих фенольных соединений уровень этих изменений очень значителен (рис. 2, таблица). Доминирующей тенденцией при тотальном анализе фракций было снижение содержания фенольных соединений. Обращает внимание, что основная тенденция сохраняется и при элиминации из выборки минорных фракций, хотя количественно она снижается. Анализ идентифицированных фенольных соединений демонстрирует другую картину соотношений фракций – доминирование соединений, содержание которых возрастает в образцах, взятых за границами очагов. В предыдущем исследовании наблюдалась другая тенденция – незначительное преобладание количества фенольных соединений, содержание которых возрастало за границами очагов [4]. Эти различия могут объясняться как разным временем взятия проб, так и различными климатическими условиями в разные годы. Сравнительный анализ климатических условий весной и летом 2014 г. [4] и 2016 г. убедительно показал, что в мае 2014 г. наблюдалась умеренная засуха (ГТК=0,415), июне и июле, наоборот, ГТК было заметно выше нормы (1,54 и 1,88). В 2016 г. в мае отмечалась интенсивная засуха (ГТК=0,159), в июне ГТК была в норме (1,17), июле – умеренная засуха (ГТК=0,497). Мы предполагаем, что столь разнонаправленные тенденции обусловлены тем, что одновременно наблюдаются два биохимических процесса: Это реакция на фактор абиотического стресса (сильную майскую засуху) и активизация антиоксидантных процессов в листьях, которая всегда наблюдается при воздействии сильной засухи. Как установлено нами ранее, более интенсивная реакция на фактор абиотического стресса (сильную майскую засуху) наблюдается в березняках в затухших очагах [4]. Она проявляется в ингибировании синтеза фенольных соединений. Вторая реакция (активизации процессов антиоксидантной защиты) сопровождается возрастанием интенсивности синтеза фенольных соединений, так как известно, что многие флавоноиды являются мощными антиоксидантами [8]. Для проверки этого предположения мы провели сравнительный анализ соотношения идентифицированных нами фенольных соединений, обладающих по данным литературы антиоксидантной активностью в затухших очагах и за их границами. Как показали результаты, в контрольных насаждениях заметное возрастание антиоксидантной активности наблюдалось у 60 % фенольных соединений, снижение – у 33,3 %, отсутствие изменений – у 6,67 % (таблица). Соответственно, в затухших очагах возрастание содержания фенольных соединений с антиоксидантной активностью выявлено лишь у 33,3 % фракций. Таким образом, в низкорезистентных насаждениях доминировало ингибирование синтеза фенольных соединений, тогда как в высокорезистентных – антиоксидантная реакция. Тем не менее, в целом, доминирование в составе фенольных соединений у образцов, взятых за границами очагов, у которых содержание заметно возрастает (у идентифицированных соединений), а также заметное возрастание активности синтеза таких фенолгликозидов, как арбутин и салицин, детерминирующих уровень энтоморезистентности в листьях, свидетельствует о том, что в древостоях за границами очагов, где постоянно отсутствует дефолиация, и в период депрессии численности насекомых наблюдается более высокий постоянный уровень конститутивной резистентности.