Нарушения в системе гемостаза являются ключевым звеном патогенеза многих заболеваний и критических состояний, характеризующихся повреждением эндотелия, нарушениями реологии крови, взаимодействия эндотелия с плазменными ферментными системами и клетками крови, тромбоцитами в первую очередь [1]. В связи с тем что именно тромбоциты играют ключевую роль в инициации тромбообразования, ингибирование их активности представляет собой один из наиболее перспективных способов профилактики и терапии тромбозов. В исследованиях, проведенных за последние десятилетия, показана необходимость и эффективность снижения угрозы тромбообразования с помощью специфических воздействий, в частности применения антиагрегантов [7]. Результаты ранее проведенных исследований, направленных на поиск потенциальных антиагрегантов в ряду впервые синтезированных тиетансодержащих солей производных ксантина, мотивируют на дальнейший поиск потенциальных корректоров системы гемостаза среди производных данного ряда [3; 8]. В настоящей работе представлены результаты скрининга и изучение антиагрегационного эффекта наиболее активного из синтезированных тиетансодержащих производных ксантина.
Цель: оценить влияние 10 синтезированных тиетансодержащих производных ксантина [4] на систему гемостаза in vitro и сравнить с применяемыми в медицине лекарственными препаратами.
Материалы и методы
Вся экспериментальная работа выполнена на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет в условиях in vitro в соответствии с рекомендациями «Руководства по доклиническому изучению новых фармакологических веществ» [2]. Исследование было одобрено этическим комитетом ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России (№ 2 от 17.10.2012). Информированное согласие было получено у всех участников исследования до забора крови.
1. Взятие крови и центрифугирование
Взятие крови проводили из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer® (Dickinson and Company, США). В качестве стабилизатора венозной крови использовали 3,8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении 9:1.
Все тесты проводили на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 100g в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы - при 300g в течение 15 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (Россия).
2. Агрегация тромбоцитов
Исследование влияния новых производных ксантина и препаратов сравнения на агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro на крови человека осуществляли с помощью лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «Биола 230LA» (Москва, Россия) [5]. В качестве индуктора агрегации использовали коллаген в концентрации 5 мг/мл производства «Технология-Стандарт» (Барнаул, Россия). Определение активности исследуемых производных проводили в концентрации 2×10-3 М/л. При анализе агрегатограмм обращали внимание на спонтанную агрегацию тромбоцитов, вызванную введением исследуемого вещества в плазму, рассчитывали степень подавления или усиления агрегации под действием производных ксантина, оценивали дезагрегационный эффект соединений.
3. Антикоагуляционная активность
Определение антикоагуляционной активности впервые синтезированных соединений и гепарина натрия проводили общепризнанными клоттинговыми тестами на турбидиметрическом гемокоагулометре Solar CGL 2110 (ЗАО «СОЛАР», Беларусь). Изучались показатели активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), протромбинового времени (ПВ) и концентрации фибриногена по A. Clauss [2]. Определение антикоагуляционной активности исследуемых веществ проводили в концентрации 10-3 г/мл. В работе использовались реактивы производства «Технология-Стандарт» (Барнаул, Россия).
4. Тромбоэластография
Тромбоэластографию проводили на аппарате TEG 5000 (Haemoscope Corporation, США). При анализе тромбоэластограмм определяли общую тенденцию коагуляции (R, CI, TMA, TPI), функциональную активность тромбоцитов и фибриногена (МА, Angle), активность фибринолиза (CLT, CL30, LY30) и физико-механические свойства образовавшихся сгустков (E, G) [6]. В качестве активатора ТЭГ использовали 0,2 М р-р CaCl2 («Технология-Стандарт», Россия).
5. Препараты сравнения
В качестве препаратов сравнения, согласно [2] из принципа химического подобия и установленной высокой биологической активности, в экспериментах использовали 3,7-диметил-1-(5-оксогексил)ксантин («Пентоксифиллин», ОАО «Дальхимфарм», Россия), соль 1,3,7-триметилксантина с бензоатом натрия («Кофеин-бензоат натрия», ОАО «Дальхимфарм», Россия), соль 1,3-диметилксантина с 1,2-этилендиамином («Эуфиллин», ОАО «Дальхимфарм», Россия), 2-ацетилоксибензойная кислота («Ацетилсалициловая кислота», фармацевтическая фабрика Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Ко., ЛТД, Китай) и гепарин натрия (ОАО «Синтез», Курган, Россия).
6. Обработка результатов
Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Выявлено, что вид распределения полученных данных отличается от нормального, поэтому при дальнейшей работе использовались непараметрические методы. Данные представлены в виде медианы, 25 и 75 процентилей. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05.
Результаты и их обсуждение
Результаты исследования влияния новых производных ксантина на адгезивно-агрегационную функцию тромбоцитов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние впервые синтезированных производных ксантина и препаратов сравнения на показатели функциональной активности тромбоцитов, Ме (25-75)
|
№ |
Шифр |
Удлинение АПТВ, % к контролю |
Антиагрегационная активность, % к контролю |
|
1 |
I |
4,7 (3,5-5,6) |
4,7 (3,2-5,4) |
|
2 |
II |
7,5 (5,9-8,3) |
6,8 (5,2-8,3)* |
|
3 |
III |
7,2 (5,6-8,3) |
3,1 (2,6-5,2) |
|
4 |
IV |
8,4 (6,1-9,3) |
7,2 (6,1-8,5)* |
|
5 |
V |
8,6 (6,3-9,4) |
2,3 (1,5-2,9) |
|
6 |
VI |
5,2 (4,1-6,4) |
6,7 (5,2-8,9)* |
|
7 |
VII |
2,4 (1,9-3,5) |
5,1 (3,0-7,7) |
|
8 |
VIII |
3,9 (2,1-5,2) |
7,2 (5,4-9,3)* |
|
9 |
IX |
9,8 (8,1-10,4) |
3,4 (2,2-4,7) |
|
10 |
X |
1,8 (1,1-2,4) |
9,1 (8,1-11,6)* |
|
11 |
Эуфиллин |
- |
2,5 (0,8-4,2) |
|
12 |
Кофеин-бензоат натрия |
- |
5,3 (3,9-7,2) |
|
13 |
Аспирин |
- |
0,0 (0,0-0,0) |
|
14 |
Пентоксифиллин |
- |
0,0 (0,0-0,0) |
|
15 |
Гепарин натрия |
54,7 (47,7-60,2) |
- |
Примечание: * - уровень статистической значимости различий в сравнении с кофеин-бензоат натрием р<0,05, n-частота наблюдений.
По результатам проведенного исследования установлено, что ацетилсалициловая кислота и пентоксифиллин не оказывают влияния на агрегацию тромбоцитов, индуцированную коллагеном. Среди лекарственных препаратов группы ксантина наибольшая активность регистрировалась у кофеин-бензоат натрия. При предварительной инкубации кофеин-бензоат натрия в обогащенной тромбоцитами плазме в течение 3 минут, происходило снижение коллаген-индуцированной агрегации в среднем лишь на 5,3% относительно контроля. Синтезированные соединения показали различной степени выраженности антиагрегационную активность, превышающую показатели препаратов сравнения. Соединения под лабораторными шифрами II, IV, VI, VIII, X проявили антиагрегационную активность, превосходящую показатели препаратов сравнения. Наибольшую активность проявило соединение под лабораторным шифром X. В присутствии соединения X агрегация тромбоцитов снижалась в среднем на 9,1%. Дезагрегационная активность у экспериментальных соединений и препаратов сравнения не регистрировалась.
Соединения показали различной степени выраженности влияние на плазменный компонент гемостаза, проявляющееся изменением показателя внутреннего пути свертывания крови – АПТВ. На показатели концентрации фибриногена и ПВ исследуемые вещества и гепарин натрия влияния не оказывали. Синтезированные производные ксантина по уровню антикоагуляционной активности уступали препарату сравнения - гепарину натрия. Максимальное удлинение времени свертывания плазмы в тесте АПТВ не превышало 10% для исследуемых соединений. Однако сочетание антиагрегационной и антикоагуляционной активности может свидетельствовать о более широком и эффективном антитромботическом потенциале данных соединений. По результатам скрининга выбрано наиболее активное соединение под лабораторным шифром X, проявляющее антиагрегационную активность большую, чем препараты сравнения, и антикоагуляционную активность на уровне 8,6%.
Следующим этапом определили влияние соединения X на систему гемостаза методом тромбоэластографии, позволяющим оценить систему гемостаза в комплексе по основным ключевым звеньям. Результаты исследования представлены в таблице 2 и на рисунке.
Таблица 2
Показатели тромбоэластографии при действии соединения X, Ме (25-75)
|
Показатель |
Контроль, n=7 |
Соединение X, n=7 |
p |
|
SP, мин |
10,3 (7,5-12,3) |
11,3 (9,4-12,1) |
0,1 |
|
R, мин |
11,6 (9,7-13,2) |
11,7 (10,4-12,5) |
0,2 |
|
Angle, град. |
43,7 (42,4-44,3) |
42,1 (39,1-43,7) |
0,3 |
|
MA, мм |
55,9 (51,2-57,8) |
44,8 (42,1-45,3) |
0,001 |
|
TMA, мин |
35,4 (32,4-38,5) |
39,6 (37,6-41,2) |
0,01 |
|
G, дин/см2 |
6,3 (5,7-6,4) |
4,9 (3,7-5,1) |
0,008 |
|
E, дин/см2 |
127,3 (115,4-142,3) |
106,4 (96,7-110,2) |
0,001 |
|
TPI, /сек |
15,1 (13,2-17,1) |
12,4 (11,2-14,3) |
0,003 |
|
CL30, % |
97,5 (91,3-99,5) |
98,4 (96,4-99,8) |
0,4 |
|
LY30, % |
0,6 (0,2-0,9) |
0,0 (0,0-0,0) |
0,3 |
|
CLT, мин |
36,9 (32,4-38,3) |
35,4 (32,1-37,4) |
0,2 |
|
CI |
0,6 (0,3-1,3) |
-1,3 (-1,1/-1,9) |
0,001 |
Примечание: p - уровень статистической значимости различий признаков группы соединения X в сравнении с контролем, n - количество проб.
1
2 
Примеры тромбоэластограмм цитратной крови в контроле (1) и в присутствии соединения Х (2)
Результаты комплексного метода оценки состояния системы гемостаза методом тромбоэластографии в присутствии соединения X свидетельствуют о проявлении исключительно антиагрегационного эффекта. Принципиальным в данном случае является изменение показателя активности тромбоцитов (МА) на фоне нормального количества тромбоцитов и фибриногена. Показатель МА в присутствии соединения X снижен на 19,9% (p=0,001) по сравнению с контролем. Это приводит к статистически значимому снижению общего коагуляционного потенциала в сторону гипокоагуляции – показатель TMA удлиняется на 11,8% (p=0,001), а TPI уменьшается в 1,3 раза (p=0,003) в сравнении с контролем. Изменяются и механико-физические свойства сгустка: показатели E и G снижены в группе соединения X в 1,3 раза по сравнению с контролем. Показатели, ответственные за систему фибринолиза (CLT, CL30, LY30), остаются на уровне контрольных значений. Таким образом, методом тромбоэластографии подтвержден антиагрегационный эффект нового соединения X в отношении функциональной активности тромбоцитов.
Заключение
Среди впервые синтезированных производных ксантина найдены соединения, превосходящие по антиагрегационной активности ряд применяемых в настоящее время препаратов. Полученные результаты свидетельствуют о высоком антитромботическом потенциале синтезированных соединений, что свидетельствует о перспективности дальнейшего поиска потенциальных антиагрегантов среди тиетансодержащих производных ксантина для создания на их основе избирательно действующих, высокоэффективных лекарственных препаратов.