Он блокирует фермент, ответственный за синтез холестерина, тем самым снижая его выработку в организме. Флавоноиды, в том числе и ДГК, повышают активацию Т-лимфоцитов путем стимулирования выработки интерферонов, таким образом, ДГК является эффективным иммуномодулятором [4]. В данной работе изучено влияние ДГК на генерацию активных форм кислорода в водной среде под воздействием ионизирующей радиации. Цель данной работы заключалась в исследовании антиоксидантных свойств дигидрокверцетина при радиолизе воды, индуцированном рентгеновским излучением.
Материалы и методы исследования.
В работе использовали высокоочищенные препарат дигидрокверцетин (ЗАО НПФ «Флавит», Россия), пеpекиcь водоpода (XимМед, Pоccия), кумаpин-3-каpбоновую киcлоту, 7-ОН-кумаpин-3-каpбоновую киcлоту (Aldrich, CША), Тpиc(гидpокcи-метил)аминометан, 2,2´-азино-ди(3-этил-2,3-дигид-pобензотиазолин-6-cульфонат) аммония (ABTS) (Sigma, CША). Также использованы следующие соли: NaH2PO4·2H2O и Na2HPO4·2H2O (Amresco, США).
Облучение. Облучение растворов проводили на рентгеновской терапевтической установке РУТ-15 (15 мA, 200 кВ) (МосРентген, Россия) при мощности дозы 4 Гр/мин (фокусное расстояние 0,195 м) (Центр коллективного пользования ИБК РАН).
Определение концентрации гидроксильных радикалов. Для количественного определения концентрации гидроксильных радикалов в растворе использовали специфичный для ОН-радикалов флуоресцентный зонд - кумарин-3-карбоновую кислоту [9]. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, Австралия) (Центр коллективного пользования ИТЭБ РАН) с λex = 400 нм, λem = 450 нм. Калибровку производили с помощью коммерческой 7-ОН-кумарин-3-карбоновой кислоты.
Определение содержания перекиси водорода в растворе.
Для количественного определения перекиси водорода in vitro мы попытались использовать высокочувствительный метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол-4-йодофенол-пеpокcидаза [5]. Однако оказалось, что ДГК восстанавливал люминол, что приводило к тушению сигнала. Поэтому для определения перекиси водорода нами был разработан методический подход с использованием красителя 2.2'-азино-ди-3-этил-2.3-дигидробензотиазолин-6-сульфоновой кислоты (ABTS). Данный краситель, оказался удобным для определения перекиси водорода, поскольку спектр его поглощения не перекрывается со спектром поглощения ДГК при длине волны 405 нм, на которой обычно измеряют оптическую плотность ABTS.
В ходе эксперимента растворы облучали рентгеновским излучением при различных концентрациях ДГК в фосфатном буфере (1мМ, рН 7,4) после чего наносили аликвоты образцов на дно лунок 96-луночных планшет по 100 мкл/лунку. Затем добавляли равный объем красящего раствора, содержащего ABTS и пероксидазу в цитратном буфере (0,1 М, рН 4,0). Оптическую плотность образцов измеряли на планшетном фотометре (Thermo Scientific, Финляндия), используя длину волны 405 нм. Содержание перекиси водорода рассчитывали, используя калибровочные графики оптической плотности известной концентрации перекиси водорода в растворе. Исходную концентрацию перекиси водорода, используемую для калибровки, определяли спектрофотометрически при длине волны 240 нм c использованием коэффициента молярного поглощения 43,6 М-1×cм-1 [8].
Результаты и их обсуждение
Исследовано влияние ДГК в концентрациях 0,1, 0,5, 1 ммоль/л на радиационно-химический выход ОН-радикалов при воздействии рентгеновского излучения в дозе 1 Гр.
При добавлении ДГК в концентрациях 0,1 ммоль/л, 0,5 ммоль/л и 1,0 ммоль/л происходит уменьшение образования ОН-радикалов в водной среде на 14 %, 60% и 80% соответственно по сравнению с контролем (таб.1). Радиационно-химические выходы ОН-радикалов в воде 242 нмоль/л/Гр, в присутствии ДГК в концентрациях 0,1; 0,5; 1,0 ммоль/л радиационно-химические выходы равны 34; 155; 198 нмоль/л/Гр соответственно. Таким образом, ДГК в существенной мере снижает выход радиационно-индуцированных гидроксильных радикалов в водных растворах.
Таблица 1
Влияние ДГК в концентрации 0,1; 0,5; 1,0 ммоль/л на образование перекиси водорода под действием рентгеновского излучения в дозе 10 Гр. Указаны средние значения и их стандартные ошибки (n=3)
|
Концентрация дигидрокверцетина, ммоль/л |
Доза облучения, Гр |
Концентрация Н2О2, нмоль/л |
|
0 0 0,1 0,5 1,0 |
0 10 10 10 10 |
< 4 803 ± 53 681 ± 42 482 ± 36 246 ± 25 |
При добавлении ДГК в концентрациях 0,1 ммоль/л, 0,5 ммоль/л и 1,0 ммоль/л происходит уменьшение образование перекиси водорода примерно на 20%, 40% и 70% соответственно по сравнению с контролем (таб. 2). Таким образом, при увеличении концентрации ДГК радиационно-индуцированная генерация перекиси водорода уменьшается. Данные радиационно-химического выходов были получены ранее. [10] В воде под действием ионизирующего излучения образуется около 80,5 нмоль/л/Гр перекиси водорода. Было показано, что в присутствии ДГК в концентрациях 0,1; 0,5; 1,0 ммоль/л радиационно-химические выходы равны 12; 32; 56 нмоль/л/Гр соответственно. Таким образом, ДГК в существенной мере снижает выход радиационно-индуцированной перекиси водорода в водных растворах.
Таким образом, дигидрокверцетин при радиолизе воды, индуцированном рентгеновским излучением, проявляет существенные антиоксидантные свойства. Причем, его антиоксидантные свойства значительно более выражены, по сравнению с ранее исследованными гуанозином, инозином, ксантозином и другими пуриновыми производными [6,3,1]. Кроме того ДГК за счет комплексообразующих свойств способен выводить из организма тяжелые металлы, в том числе радионуклиды [3]. В связи с этим, дигидрокверцетин является перспективным соединением для исследования его применения как радиопротектора и радиозащитного соединения in vivo.
Таблица 2
Влияние ДГК в концентрации 0,1; 0,5; 1,0 ммоль/л на образование гидроксильных радикалов под действием рентгеновского излучения в дозе 1 Гр. Указаны средние значения и их стандартные ошибки (n=3)
|
Концентрация дигидрокверцетина, ммоль/л |
Доза облучения, Гр |
Концентрация ОН-радикалов, нмоль/л |
|
0 0 0,1 0,5 1,0 |
0 1 1 1 1 |
<1 244 ± 5 212 ± 4 90 ± 2 46 ± 2 |
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 13-04-00730-а и 14-44-03562-р_центр_а. Авторы благодарны директору ЗАО НПФ «Флавит» (Пущино) А.Б. Гаврилову за предоставленный препарат дигидрокверцетина.
Рецензенты:
Буданцев А.Ю., д.б.н. профессор, главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино;
Гудков С.В., д.б.н., ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино.