У ацетилсалициловой кислоты выделяют несколько эффектов. Основной (антитромбоцитарный) связан с угнетением агрегации тромбоцитов за счёт необратимого подавления функции циклооксигеназы - ЦОГ1 [8]. Вместе с тем важно антикоагулянтное значение препарата [6]. АСК тормозит агрегацию тромбоцитов, а также оказывает влияние на другие звенья свертывающей и противосвертывающей систем крови [7], влияет на образование реактивных форм кислорода, оказывает ульцерогенное действие [2; 4]. При этом рост относительного риска сердечно-сосудистых осложнений при прекращении использования АСК, в том числе перед хирургическими вмешательствами или в ходе ненадлежащей приверженности пациентов к лечению [10], способствует появлению интереса в поиске методов, усиливающих эффекты и обеспечивающих коррекцию побочного действия препарата.
Применение в комплексной терапии ИБС препаратов антиоксидантного типа действия, которые уменьшают последствия окислительного стресса, улучшают реологические свойства крови, а также оказывают выраженный гастропротекторный эффект при введении нестероидных противовоспалительных средств [5], определяет интерес к более подробному исследованию перспектив комбинированного использования антиоксидантов с АСК и влияния на показатели гомеостаза.
Целью работы выступили изучение влияния ацетилсалициловой кислоты с комбинаций производных таурина ЛХТК 646 и ЛХТК 648 на некоторые параметры гемостаза в эксперименте при курсовом введении с последующей отменой.
Материалы и методы. Для эксперимента выбраны следующие фармакологические соединения: производные таурина с лабораторными шифрами ЛХТК 646 и ЛХТК 648. В исследовании применяли ацетилсалициловую кислоту (АСК) (фармакологический препарат «Упсарин УПСА» производства Бристол-Майерс Сквибб, Франция) с регистрационным номером П № 011386/01.
Исследование проводилось на половозрелых кроликах обоего пола в количестве 36 штук породы шиншилла, вес которых составлял 2,6-3,8 кг. Лабораторные исследования проходили в соответствии с этическими требованиями по работе с экспериментальными животными. Животных содержали в виварии с соблюдением температурного и светового режима, в клетках размером 50х50х60 см, при стандартном питании, включающем зерно, сено, корнеплоды, со свободным доступом к воде и пище. Ежедневно в первой серии эксперимента (контроль, n=12) всем животным внутрижелудочно вводили только АСК в дозе 4 мг/кг зондовым способом в течение 10 суток. Венозную кровь для исследования параметров коагуляционного гемостаза и подсчёта тромбоцитов забирали до начала эксперимента, а также на 1, 7, 10, 14, 17, 20, 24, 27, 43 и 57-е сутки - по окончании введения ацетилсалициловой кислоты.
Соединение ЛХТК 646 в дозе 7,2 мг/кг в/м и ацетилсалициловую кислоту в дозе 4 мг/кг вводили внутрижелудочно во второй серии (n=12). В третьей серии (n=12) всем животным в эксперименте АСК вводили внутрижелудочно в дозе 4 мг/кг и соединение ЛХТК 648 в дозе 5,9 мг/кг в/м. Все препараты и соединения применялись ежедневно течение 10 суток. Венозную кровь забирали до начала эксперимента во 2-й и 3-й сериях для исследования параметров коагуляционного гемостаза и подсчёта тромбоцитов, а также на 1-е и 14-е сутки после окончания введения комбинаций.
Исследуемые показатели определяли в венозной крови. Для этого кровь забирали из краевой вены уха кроликов с помощью венесекции в пробирку с раствором цитрата натрия, для подсчёта тромбоцитов - в системы «MICROVETTE® 200» (Sarstedt, Германия). Оценивали активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), тромбиновое время (ТВ), активность антитромбина III (АТ III), протромбиновый индекс (ПТИ), концентрацию фибриногена, время рекальцификации плазмы (ВР), а также степень тромботеста (ТТ) и этанолового теста; при этом подсчитывали число тромбоцитов в венозной крови для косвенной оценки реакции тромбоцитарного звена гемостаза.
Статистическая обработка результатов осуществлялась на персональном компьютере с применением программы Microsoft Office Excel 2003 и SPSS Statiscics 17.0. Данные представлены средними арифметическими (М) и ошибками средних (±m).
Результаты исследования и их обсуждение. На фоне введения ацетилсалициловой кислоты в дозе 4 мг/кг в течение 10 дней регистрировалось изменение показателей гемостаза, которые характеризуют 1-ю фазу свертывания крови. Величина АЧТВ не изменялась, ПТИ возрастал на 19% (p<0,01). Изменение исследуемых показателей, характеризующих 2-ю фазу свертывания крови, заключалось в некотором снижении ТВ до 91% (р<0,05) и возрастании содержания фибриногена на 26% (p<0,01). ВР увеличивалось на 17% в сравнении с первоначальным (p<0,01). Указанные изменения сопровождались ростом активности АТ III с 73±1 до 79±1% (p<0,05) на фоне увеличения содержания тромбоцитов на 34% (р<0,01).
После отмены ацетилсалициловой кислоты сохранялись явно выраженные изменения коагуляционного потенциала. Так, к седьмым суткам после прекращения применения фармакологического препарата нарастали гипокоагуляционные изменения крови - по сравнению с данными по окончании курса введения ацетилсалициловой кислоты: показатель АЧТВ уменьшился до 91% (р<0,05), ПТИ оставался на 15% выше первоначальных данных, ВР составило 120% от исходного уровня (р<0,05). Показатели гемостаза, характеризующие вторую фазу свёртывания ТВ и степень ТТ, сохранялись на уровне предыдущего срока исследования, содержание фибриногена уменьшалось на 10% (р<0,05), но оставалось выше первоначального уровня. При этом активность АТ III превышала исходные данные на 11%. Содержание тромбоцитов по-прежнему оставалось на высоком уровне - на 32% выше исходного.
Нарастание гипокоагуляционного потенциала стало более выраженным через 10 суток после отмены АСК: ПТИ снизился в сравнении с предыдущим сроком наблюдения и с первоначальными данными на 31% (р<0,05). ТВ резко увеличилось как в сравнении с предыдущим сроком наблюдения (на 55%, р<0,05), так и с исходным уровнем (на 43%, р<0,05). Степень тромботеста, активность АТ III, содержание фибриногена и содержание тромбоцитов достоверно не менялись по сравнению с данными предыдущего срока наблюдения.
Механизм действия АСК связан с необратимым ингибированием циклооксигеназы тромбоцитов [8] продолжительностью 10-12 суток. Поэтому особенно интересным было изучение показателей через 14 суток после отмены препарата. Оказалось, что, несмотря на сроки, соответствующие появлению в периферической крови новой популяции тромбоцитов, не было снижения их количества, но вместе тем регистрировалась динамика показателей, свидетельствующая о некоторых гиперкоагуляционных сдвигах (рост ПТИ на 54%, уменьшение ТВ до 70%).
Спустя 17 дней после отмены ацетилсалициловой кислоты ВР активность АТ III, степень ТТ и содержание тромбоцитов оставались на прежнем уровне, не восстанавливаясь до исходных показателей. При этом АЧТВ впервые стало достоверно ниже исходного уровня на 12% (р<0,05), а ПТИ - выше на 13% (р<0,05), ТВ сокращалось до 90% (р<0,05), содержание фибриногена снижалось до 86%, достигая исходного уровня. То есть по сравнению с предыдущим сроком наблюдения фиксировалась в большей степени гиперкоагуляционная направленность сдвигов показателей гемостаза, в качестве компенсаторной реакции уменьшилось содержание фибриногена.
Через 20 дней после отмены ацетилсалициловой кислоты, в сравнении с предыдущим сроком наблюдения, продолжали увеличиваться гиперкоагуляционные сдвиги: сокращалось ВР до 90% (р<0,05) от показателя предыдущего срока исследования, при этом отмечался дальнейший прогрессивный рост содержания тромбоцитов.
После 24 суток от прекращения приема ацетилсалициловой кислоты отмечена тенденция к нормализации отдельных изученных показателей гемостаза: ВР увеличивалось, ПТИ начинало снижаться, ТВ - сокращалось до исходного уровня. Содержание тромбоцитов также начинает постепенно снижаться, но пока еще оставалось выше исходного на 20%. Через 27 суток после отмены АСК осуществлялось восстановление до исходного уровня большинства показателей, таких как содержание тромбоцитов, степень ТТ, ПТИ, ТВ, АЧТВ. Но одновременно с тем сохранялась на прежнем повышенном уровне активность АТ III, ВР оставалось больше исходного, а содержание фибриногена снижалось до 76%. То есть в этот период в целом динамика показателей характеризовалась гипокоагуляционной направленностью.
Через 43 дня после прекращения применения препарата АСК так и не наблюдалось полной нормализации показателей: ВР еще не достигало исходных данных, фибриноген не сохранялся на несколько сниженном уровне, активность АТ III была выше исходных данных. Через 57 дней после отмены ацетилсалициловой кислоты большинство исследуемых показателей возвращалось к исходному уровню.
В итоге до 57 дней после отмены ацетилсалициловой кислоты отмечались колебания показателей гемостаза, характеризующих сначала гипокоагуляционную направленность (к 7-10-м суткам), а затем - гиперкоагуляционную (14-24-е сутки). После 24 суток (27-53-и сутки) динамика показателей вновь отражает гипокоагуляционные тенденции, отмечается постепенная стабилизация изучаемых параметров: их колебания становятся сглаженными, а сами значения в большинстве случаев приближаются к первоначальным.
Сочетанное использование АСК и ЛХТК 646 в изученных дозах в течение 10 суток усилило гипокоагуляционные сдвиги крови: увеличило ВР на 32% в сравнении с исходным, АЧТВ - на 39%, ПТИ - на 18%. Активность АТ III увеличилась на 34%. Численность тромбоцитов при применении комбинации повысилась с 349±41·109/л до 461±32·109/л (р<0,05). К 14-му дню после отмены сочетаний ацетилсалициловой кислоты и ЛХТК 646 понизилось ВР и активность АТ III до начального уровня. ПТИ продолжал увеличиваться (на 24% выше от исходного значения). ТВ уменьшилось на 14% от начальных значений. Концентрация фибриногена (2197±60 мг/л) была уменьшена до 64% значения предшествующего срока наблюдения и на 28% - от начальных значений. Численность тромбоцитов составила 398±62·109/л и не отличалась от начальных показателей.
Сочетанное использование АСК и ЛХТК 648 в течение 10 суток в изученных дозах привело к повышению ВР на 29% (р<0,05) по сравнению с начальным, АЧТВ - на 27% (р<0,05), ПТИ - на 25% (р<0,05). Существенно увеличилась и активность АТ III - на 36% (р<0,05). В то же время наблюдалась противоположная динамика по ТВ: значение сократилось до 86% (с 9,6±0,3 до 8,3±0,2 с, р<0,05). Число тромбоцитов на фоне сочетанного курсового применения АСК и ЛХТК 648 увеличилось почти в 1,5 раза: с 347±44 до 507±55·109/л. (р<0,001). Спустя 14 дней после прекращения применения сочетания АСК и ЛХТК 648 существенно снизились ВР и активность АТ III. Наоборот, ПТИ продолжал повышаться и дошел 207±14% индекса (на 30% выше начального значения, р<0,01). ТВ уменьшилось до 8,0±0,3 с, что на 17% меньше исходных данных (р<0,05). Концентрация фибриногена была меньше на 19% исходных цифр (2240±135 против начальных 2777±139 мг/л; р<0,05). Число тромбоцитов не различалось от начальных значений, составив 363±58·109/л.
Сравнительный анализ изучаемых значений показал, что ВР и активность АТ III были выше во второй (ЛХТК 646 и АСК) и третьей серии (ЛХТК 648 и АСК) (p<0,05). В сравнении с серией контроля концентрация фибриногена оказалась более низкой (p<0,05), а показатель ТВ - значительно увеличенным (p<0,05). АЧТВ также увеличилось значительно в сериях с использованием производных таурина, особенно во второй серии (ЛХТК 646 и АСК) (p<0,05) в сравнении с использованием только АСК.
Через 14 дней после прекращения применения АСК в 1-й серии происходило повышение ВР, но в других сериях значение возвращалось к начальным значениям. Также увеличилось ТВ. В первой серии (АСК) ПТИ после прекращения применения фармакологического препарата стал возвращаться к начальному уровню (уменьшился до 90%, p<0,05), хотя во всех исследуемых сериях значение продолжило увеличиваться. Значение АЧТВ: в опытных группах ограничивалась степень понижения показателя по сравнению с данными контроля (p<0,05). Во 2-й (ЛХТК 646 и АСК) и 3-й сериях (ЛХТК 648 и АСК) было зафиксировано уменьшение концентрации фибриногена (до 64% и 70% соответственно; p<0,05) и активности АТ III (до 84% и 81% соответственно; p<0,05). В опытных группах уменьшилась степень ТТ и содержание тромбоцитов в крови.
При использовании только ацетилсалициловой кислоты в течение 10 дней встречались как прокоагуляционные (повышение концентрации фибриногена, ПТИ и числа тромбоцитов, понижение ТВ), так и гипокоагуляционные сдвиги (рост ВР, АЧТВ и активности АТ III). Сочетание АСК с производными таурина (ЛХТК 648 и ЛХТК 646) дало такой же по течению, но гораздо более проявленный эффект. К 14-му дню после отмены АСК значения сместились в сторону повышения коагуляционного потенциала: АЧТВ снизилось в сравнении с исходным, а концентрация фибриногена - увеличилась. После прекращения применения комбинации АСК с производными таурина достигнутый в течение 10 суток использования сочетаний эффект почти полностью нивелировался.
Заключение. Таким образом, после прекращения использования АСК в дозе 4 мг/кг начинаются значительные изменения гемокоагуляционного потенциала: сначала в сторону гипокоагуляции (к 7-10-м суткам), потом - гиперкоагуляции (17-24-м сутки) и менее выраженное смещение в сторону гипокоагуляции после 24-х суток с постепенной стабилизацией большинства исследуемых значений венозной крови кроликов. Сочетанное использование ацетилсалициловой кислоты и сочетаний ЛХТК 648 (5,9 мг/кг) или ЛХТК 646 (7,2 мг/кг), в сравнении с применением АСК в виде монотерапии, оказывает значительное гипокоагуляционное действие, увеличивая сроки рекальцификации плазмы и АЧТВ, увеличивая активность антитромбина III, а также предупреждая рост содержания фибриногена. Гипокоагуляционное действие сочетаний ацетилсалициловой кислоты и соединений ЛХТК 646 или ЛХТК 648 при курсовом применении значительно более выраженное, чем соединений ацетилсалициловой кислоты с мексидолом или этоксидолом в изученных дозах: в большей степени повышается время рекальцификации, АЧТВ, активность антитромбина III, но при этом не предупреждается увеличение числа тромбоцитов в венозной крови кроликов. Спустя 14 дней после прекращения использования сочетаний ацетилсалициловой кислоты и соединений ЛХТК 646, и особенно ЛХТ 648, в отличие от данных после прекращения приема ацетилсалициловой кислоты соответствующего срока наблюдения, восстанавливается большинство изученных значений гемостаза.
Рецензенты:
Инчина В.И., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии Медицинского института ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева», г. Саранск;
Столярова В.В., д.м.н., профессор, профессор кафедры госпитальной терапии Медицинского института ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева», г. Саранск.