Понятие недоношенности подразумевает рождение ребенка ранее 37 недель гестации. Частота преждевременных родов во многих странах достигает 11-15% , ежегодно рождается преждевременно 15 миллионов недоношенных новорожденных, при этом преждевременные роды обуславливают до 35 % неонатальной смертности [1]. Выжившие недоношенные младенцы имеют высокую заболеваемость, повышенный риск кровоизлияний в мозг, гормональных и неврологических нарушений, респираторных заболеваний, нарушений зрения [1]. Но самое главное, недоношенные дети крайне чувствительны к инфекции, что является важным фактором, определяющим их высокую смертность и заболеваемость. Иммунная система является основной в поддержании противоинфекционного гомеостаза. Расширение возможностей современной медицины в выхаживании новорожденных, начиная с 22 недель гестации, обуславливает особую значимость изучения механизмов функционирования иммунной системы глубоко недоношенных детей. И более того, их иммунная система может подвергаться и дальнейшему воздействию неблагоприятных факторов, приводя к еще большему ее угнетению. У них отмечается нарушение как врожденного, так и адаптивного иммунитета, что может сопровождаться индукцией иммунной толерантности и ослаблением защитных реакций противоинфекционного иммунитета [1] и как следствие к развитию инфекционно-воспалительных заболеваний. Среди иммунных механизмов, обеспечивающих первые этапы противоинфекционной защиты, наибольший интерес представляют реакции врожденного иммунитета, особенно связанные с начальными этапами развития иммунного ответа, т.е. с процессом распознавания патогенов. Ключевым моментом в этом процессе является взаимодействие между патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (РАМР), широко представленными в структуре большинства бактерий и вирусов и паттерн-распознающими рецепторами (PRR), представленными на клетках иммунной системы, осуществляющих реакции врожденного иммунитета. Это взаимодействие запускает передачу активационных сигналов, ведущих к выработке провоспалительных цитокинов и развитию каскада инфекционно-воспалительных реакций, направленных на блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление патогена из организма. Некоторые из этих рецепторов опосредуют реакции эндо- и фагоцитоза, например рецепторы комплемента (интегрины) и FcR. Другие, такие как Toll-like рецепторы (TLR) - инициируют активацию клеток врожденного иммунитета. Все это обуславливает актуальность исследований, посвященные изучению этой проблемы.
В связи с этим целью проведенного исследования было выявить особенности экспрессии Toll-like рецепторов 2-, 4-, 9-типов (TLR2, TLR4, TLR9), CD11b (β2 интегрин) и CD16 молекул (FcγRIII) моноцитами и нейтрофилами у недоношенных новорожденных.
Материалы и методы исследования.
В перинатальном центре ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им.В.Н.Городкова» МЗ РФ проводилось обследование 77 новорожденных в 1-2 сутки жизни. В исследование вошли 11 новорожденных 34-37 недель гестации (масса тела при рождении 1550-2390г), 38 новорожденных 31-33 недель гестации (масса тела при рождении 1257-2250г), 15 детей 29-30 недель гестации (масса тела при рождении 950-1800г) и 13 детей 22-28 недель гестации (масса тела при рождении 490-1080г).
Методом проточной трехцветной цитофлюориметрии в периферической крови новорожденных определяли относительное содержание моноцитов (CD14+CD45+) и нейтрофилов (CD14-CD45+), экспрессирующих TLR2, TLR4, TLR9, CD11b и CD16 молекулы. В работе использовались моноклональные антитела анти-CD14 PE-Cyanine7, анти-CD45 PerCP-Cyanine5.5, анти-CD282(TLR2) FITC, анти-CD284(TLR4) Alexa Fluor 488, анти-CD289(TLR9) PE, анти-CD11b FITC (eBioscience, USA) и анти-CD16 PE (Beckman Coulter, France). Результаты анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCantoII в программе FACSDiva (Becton Dickinson, USA).
Все женщины подписывали информированное согласие на проведение иммунологического обследования ребенка. Работа была одобрена этическим комитетом ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова» МЗ РФ.
Статистическая обработка полученных данных проводилась методом вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excell из комплекта Microsoft Office 2000. Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивалась по t-критерию.
Результаты исследования и их обсуждение
Механизмы взаимодействия патоген-ассоциированных молекул с паттерн-распознающими рецепторами в последнее время привлекают пристальное внимание исследователей во всем мире. Однако работы, посвященные изучению этого аспекта функционирования врожденного иммунитета у новорожденных, в большинстве своем рассматривают проблему без учета гестационного возраста и степени зрелости иммунной системы новорожденного. По данным литературы для здоровых доношенных новорожденных характерно незначительное снижение экспрессии TLR2 фагоцитами, при отсутствии существенных различий в экспрессии TLR4 по сравнению с показателями взрослых доноров [2]. В некоторых работах отмечается отсутствие стимулирующего эффекта LPS на экспрессию CD14 и TLR4 моноцитами доношенных новорожденных [3], в других показано усиление экспрессии TLR4 моноцитами пуповинной крови после стимуляции LPS, сопоставимое с таковым у взрослых доноров [4].
Результаты нашего исследования экспрессии TLR моноцитами и нейтрофилами периферической крови новорожденных разной степени недоношенности представлены в таблица 1.
Таблица 1
Экспрессия TLR2, TLR4, TLR9 молекул моноцитами и нейтрофилами новорожденных различного гестационного возраста.
|
Срок гестации |
TLR2+, % |
TLR4+, % |
TLR9+,% |
|
Моноциты |
|||
|
34-36 недели |
84,15±3,02 |
78,33±3,53 |
46,90±5,49 |
|
31-33 недели |
76,75±2,45 |
78,25±2,40 |
48,35±3,45 |
|
29-30 недель |
76,65±4,02 |
75,91±3,30 |
43,44±5,20 |
|
22-28 недели |
70,51±3,96 p1<0,02
|
67,30±4,10 p1<0,05 p2<0,05 |
31,14±3,91 p1<0,05 p2<0,01 |
|
Нейтрофилы |
|||
|
34-36 недели |
78,66±4,28 |
76,13±3,40 |
31,70±3,79 |
|
31-33 недели |
73,10±2,58 |
68,13±2,50 |
37,44±4,66 |
|
29-30 недель |
72,31±4,37 |
67,49±3,50 |
27,99±3,02 |
|
22-28 недели |
63,06±3,21 p1<0,01 p2<0,05 |
64,62±4,04 p1<0,05 |
35,15±5,69 |
p1 - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой новорожденных 34-36 недель гестации.
p2 - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой новорожденных 31-33 недель гестации.
Установлено, что у новорожденных 22-28 недель гестации в крови отмечалось снижение уровня моноцитов, экспрессирующих TLR2 (p<0,02), TLR4 (p<0,05) и TLR9 (p<0,05) по сравнению с показателями новорожденных 34-36 недель гестации. Следует отметить, что содержание в крови TLR4+ и TLR9+ моноцитов у детей 22-28 недель гестации было существенно ниже и по сравнению с показателями новорожденных 31-33 недель гестации (p<0,05 и p<0,01, соответственно), но не имело статистически значимых различий с показателями младенцев 29-30 недель гестации. Средние значения показателей содержания TLR2+, TLR4+ и TLR9+ моноцитов в подгруппах новорожденных со сроком гестации 34-36 недель, 31-33 недели и 29-30 недель практически не различались между собой (p>0,05 во всех случаях).
Экспрессия TLR на нейтрофилах у детей разной степени недоношенности имела несколько иные закономерности. Так, у детей 22-28 недель гестации уровень TLR2+ нейтрофилов был достоверно ниже, чем у новорожденных 34-36 и 31-33 недель гестации (p<0,01 и p<0,05, соответственно), в то время как снижение относительного содержания TLR4+ нейтрофилов отмечалось только относительно показателей новорожденных 34-36 недель гестации (p<0,05). Уровень TLR9+ нейтрофилов в крови новорожденных существенно не менялся в зависимости от срока гестации и оставался практически одинаковым (p>0,05 во всех случаях). Содержание TLR2+ и TLR4+ нейтрофилов не имело достоверных различий в 29-30, 31-33 и 34-36 недель гестации (p>0,05 во всех случаях), однако для групп недоношенных детей 29-30, 31-33 недель гестации были характерны тенденции к его снижению по сравнению с показателями почти новорожденных 34-36 недель гестации.
Следует отметить, что наиболее низкие значения экспрессии TLR на моноцитах и нейтрофилах отмечались у новорожденных 22-28 недель гестации. Начиная с 29-30 недель гестации, отмечалась выраженная тенденция к повышению уровня клеток экспрессирующих TLR2 и TLR4 и в популяции моноцитов, и в популяции нейтрофилов. Проведенный анализ данных содержания TLR-позитивных нейтрофилов и моноцитов показал, что группы новорожденных 29-30 и 31-33 недель гестации были неоднородными по индивидуальным значениям данных показателей. Так, показатели содержания TLR2+ и TLR4+ клеток были сниженными и соответствовали средним значениям, характерным для недоношенных 22-28 недель гестации у новорожденных 29-30 недель гестации в 20% случаев в популяции моноцитов и в 40% случаев в популяции нейтрофилов, а в группе детей 31-33 недель гестации в 21% случаев в популяции моноцитов и в 32% случаев в популяции нейтрофилов. То есть выраженные изменения в экспрессии TLR на моноцитах и нейтрофилах наблюдались в большей степени у глубоко недоношенных новорожденных и в меньшей степени затрагивали более доношенных детей.
Противоречивость литературных данных об экспрессии PRR и продукции цитокинов фагоцитами периферической крови недоношенных новорожденных по сравнению с доношенными новорожденными, вероятно, в значительной степени определяется подбором клинических групп обследованных детей. Так, одни авторы не выявили изменений в экспрессии TLR2 [5, 6] и TLR4 [7] моноцитами недоношенных новорожденных. Другие, наоборот, показали снижение уровня TLR2+ [8] и TLR4+ [5, 6] моноцитов в периферической крови недоношенных новорожденных. Наши данные в большей степени согласуются с результатами тех исследователей, которые выявили снижение уровня TLR2+ и TLR4+ нейтрофилов, и TLR4+ моноцитов, характерное для новорожденных с экстремально низкой массой тела при рождении (ЭНМТ), что соответствует глубокой степени их недоношенности [5, 6, 7]. Установленное нами снижение уровня TLR2+, TLR4+ нейтрофилов и моноцитов, и TLR9+ моноцитов показывает, что у новорожденных 22-28 недель гестации, и, частично у недоношенных 29-30 и 31-33 недель гестации, нарушаются механизмы распознавания патогенов как бактериального, так и вирусного происхождения.
Известно, что при связывании PAMP с TLR передается транскрипционный сигнал, направляющий выработку цитокинов, осуществляющих борьбу с инфекцией. Вероятно, установленное нами нарушение TLR-опосредованного распознавания патогена, является основной причиной снижения сывороточного уровня IL-1Ra, IL-2, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IFNγ, MIP-1α, MCP-1, TNFα, установленного Lusyati S. с соавт. (2013) [9], а также продукции и секреции провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα) клетками макрофагального ряда в ответ на стимуляцию РАМР у недоношенных новорожденных по сравнению с доношенными новорожденными и взрослыми донорами [5, 6].
Исследование экспрессии PRR моноцитами и нейтрофилами, характеризующих иной механизм их взаимодействия с PAMP, показало, что для группы недоношенных новорожденных 22-28 недель гестации было характерным достоверное снижение содержания моноцитов и нейтрофилов, экспрессирующих молекулы CD16 (FcγRIII) как по сравнению с показателями новорожденных 34-37 недель гестации (p<0,05 в обоих случаях), так и по сравнению с показателями новорожденных 31-33 недель гестации (p<0,05 и p<0,01, соответственно) (таблица 2).
Таблица 2
Экспрессия CD11b и CD16 молекул моноцитами и нейтрофилами новорожденных различного гестационного возраста.
|
Срок гестации |
CD11b+, % |
CD16+, % |
|
Моноциты |
||
|
34-36 недели |
76,86±5,27 |
62,61±4,72 |
|
31-33 недели |
82,66±2,22 |
58,76±3,09 |
|
29-30 недели |
81,69±3,51 |
59,65±4,40 |
|
22-28 недели |
76,33±4,52 |
48,32±3,77 p1<0,05 p2<0,05 |
|
Нейтрофилы |
||
|
34-36 недели |
84,98±4,66 |
86,14±2,91 |
|
31-33 недели |
87,47±2,49 |
86,11±1,59 |
|
29-30 недели |
90,89±2,09 |
79,56±3,15 |
|
22-28 недели |
82,68±3,55
|
76,25±2,75 p1<0,05 p2<0,01 |
p1 - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой новорожденных 34-36 недель гестации.
p2 - коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с группой новорожденных 31-33 недель гестации.
Достоверных различий в содержании CD16+ моноцитов и нейтрофилов не отмечалось между группами недоношенных новорожденных: 22-28 и 29-30 недель гестации (p>0,05); 29-30, 31-33 и 34-36 недель гестации (p>0,05 во всех случаях). Содержание CD11b+ моноцитов и нейтрофилов во всех сравниваемых группах новорожденных не имело достоверных различий (p>0,05 во всех случаях). Индивидуальных анализ данных содержания CD16+ клеток показал, что низкие значения содержания CD16+ моноцитов (соответствующие таковым в группе недоношенных новорожденных 22-28 недель гестации) отмечались у 40% детей 29-30 недель гестации и у 50% детей 31-33 недель гестации. Сниженный уровень CD16+ нейтрофилов был выявлен у 33% детей 29-30 недель гестации и у 20% детей 31-33 недель гестации.
Данные о характере экспрессии Fc-рецепторов и С3-рецепторов моноцитами и нейтрофилами недоношенных новорожденных свидетельствуют о том, что у глубоко недоношенных новорожденных 22-28 недель гестации и в некоторой степени у недоношенных старше 28 недель гестации, в основном страдает функция опсонизированного фагоцитоза. Следует отметить, что по данным литературы плазма недоношенных детей обладает значительно более низкой опсонирующей емкостью к некоторым бактериальным патогенам, чем у доношенных новорожденных [7]. В большей степени это проявлялось в группе детей с экстремально низкой массой тела при рождении [7].
Заключение. Таким образом, в нашем исследовании мы выявили некоторые особенности экспрессии паттерн-распознающих рецепторов моноцитами и нейтрофилами, зависящие от гестационного возраста новорожденных. В максимальной степени угнетение функции распознавания и фагоцитоза патогена проявлялось у глубоко недоношенных новорожденных 22-28 недель гестации, и постепенно ослабевало с увеличением гестационного возраста ребенка.
Как показывает практика, в значительном числе случаев досрочное прерывание беременности и рождение детей с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении обусловлено развитием воспалительных реакций в плаценте, амниотической жидкости, плодовых оболочках [1] в результате бактериального и/или вирусного инфицирования. Этот процесс сопровождается и внутриутробным инфицированием новорожденных, которое отмечается у 83% детей с массой тела менее 1000 г при рождении и лишь у 10% детей, превышающих 2500 г [1].
В настоящее время трудно однозначно ответить на вопрос, чем может в большей степени определять снижение уровня патоген-распознающих клеток у недоношенных малых гестационных сроков. С одной стороны укорочение периода внутриутробного развития сопровождается морфологической и функциональной незрелостью многих органов и систем, в том числе и иммунной системы. С другой стороны можно предположить, что находясь в длительном контакте с патогеном еще во внутриутробном состоянии, иммунная система плода исчерпывает свои возможности в результате сброса или интернализации PRR фагоцитами, либо в результате ускоренного прохождения клетками всего процесса созревание → активация → реализация функции → апоптоз. Наиболее вероятным представляется предположение, что именно неполноценность реакций иммунной системы у глубоко недоношенных новорожденных определяет их особую подверженность инфекционно-воспалительным заболеваниям, протекающих длительно и в очень тяжелой форме.
Рецензенты:
Анциферова Ю.С., д.б.н., старший научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии, ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им.В.Н.Городкова» МЗ РФ, г. Иваново;
Панова Ирина Александровна, доктор медицинских наук, заведующая отделом акушерства и гинекологии, ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им.В.Н.Городкова» МЗ РФ, г. Иваново.