Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

RESEARCH OF INFLUENCE OF ORANGE-RED COMPONENT (λMAX=626 NM) IN MODEL SUNLIGHT SPECTRUM ON THE VIABILITY OF MAMMALIAN CELL IN VITRO.

Fakhranurova L.I. 1 Selezneva I.I. 1 Manoxin A.A. 2 Davydova G.A. 1 Khramov R.N. 1
1 Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of RAS
2 Institute of Cell Biophysics of RAS
Проведено исследование воздействия оранжево-красной компоненты (λmax=626 нм), полученной с помощью экранов, состоящих из люминофорсодержащих материалов, в спектре солнечного света на жизнеспособность клеток млекопитающих (фибробласты линии 3Т3 clone NIH; эпителиальные клетки линии НЕр-2 и клетки роговицы глаза кролика линии SIRC) в условиях in vitro. Проведенное нами исследование показало, что наличие даже небольшой по интенсивности дополнительной люминесцентной компоненты (λмакс=626нм) в спектре солнечного света приводит к стимуляции внутриклеточных процессов и повышению регенеративных возможностей организма, что выражается в увеличении жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста. Это открывает перспективы применения светопреобразующих материалов для защиты тканей глаза от фотоповреждения и профилактики дистрофических и возрастных изменений макулярной области сетчатки.
We have done the study of the effect of orange-red component (λmax = 626 nm) in the solar spectrum, obtained through the screens consisting of luminophore materials, on the viability of mammalian cells (fibroblasts 3T3 clone NIH; epithelial cell line HEp-2 cells and rabbit cornea line SIRC) in vitro. Our study showed that the presence of even small-intensity fluorescent additional components (λmax = 626nm) in the spectrum of sunlight leads to stimulation of intracellular processes and improve the regenerative abilities, resulting in an increase in cell viability according to the MTT assay. This opens up prospects of using light-converting material to protect the eye tissues from photodamage and prevention of degenerative and age-related changes in the macular area of the retina.
cytoprotection
retina
biocompatible sun-converting materials

Из года в год растет интерес к фототерапии при профилактике и лечении ряда заболеваний. Наиболее часто в фототерапии применяют низкоинтенсивное излучение лазеров и светодиодных ламп [3, 6]. Альтернативой является источник белого света, излучение которого модулируется с помощью светофильтров [7]. Предлагаемый нами подход основан на использовании преобразованного солнечного света (ПСС), получаемого при помощи светофильтров с включением полупроводниковых нанокристаллов или квантовых точек (КТ), преобразующих УФ-компоненту солнечного спектра в свет оранжево-красного диапазона (λmax=626 нм). В литературе имеются лишь единичные упоминания об использовании преобразованного таким образом солнечного света для биомодуляции функций животных организмов, в частности при фотостимуляции репаративных процессов [5]. Целью данной работы было исследовать влияние оранжево-красной компоненты (λmax=626 нм) в спектре преобразованного модельного солнечного света на жизнеспособность клеток млекопитающих в условиях in vitro.

Материал и методы исследования

В качестве фотолюминофоров были взяты полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы CdSe/CdS (квантовые точки, КТ) размером 5-7 нм (НТИЦ «Нанотех-Дубна»). Спектры возбуждения и эмиссии КТ получали на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, США). Энергетическая освещённость световых потоков измерялась пиранометром CMP-3 (Kipp & Zonen, Нидеpланды). Облучение клеток с помощью лабораторного осветителя ЛОС-1 (Россия) с ксеноновой лампой OSRAM XBO150 (мощность 150 Вт), излучение которой в видимом диапазоне и в УФ- диапазоне спектра близко к спектру излучения Солнца, падающего на поверхность Земли (группа СС). Светопреобразующие экраны были изготовлены из пластин полиметилфенилсилоксана (ПФМС) толщиной 0,5 мм, с включением 0,1% квантовых точек CdSe/CdS, получаемый при этом световой поток называли преобразованным солнечным светом (группа ПСС). В качестве контроля использовали такие же пластины ПМФС без включения квантовых точек, которые поглощали свет, в том числе в УФ-диапазоне в той же мере, как и светопреобразующие экраны  (группа CC-УФ). Расчетные данные по дозам облучения при использовании различных режимов облучения приведены в таблице 1. Нагрев среды культивирования во время проведения эксперимента не превышал 0,1ºC.

Таблица 1. Расчет  экспозиционной дозы облучения при различных режимах.

Продолжительность облучения (сек)

Группа СС (Дж/см2)

Группа СС-УФ (Дж/см2)

Группа ПСС (Дж/см2)

2

0,3

0,051

0,051

50

6,5

1,1

1,1

150

19

3,2

3,3

600

77

12,8

13,3

1200

154

25,6

26,6

1800

231

38,4

39,9

Исследование in vitro проводили с использованием фибробластов линии 3Т3 clone NIH и эпителиальных клеток линии HEp-2 из коллекции клеточных культур Института Биофизики Клетки РАН, а также клеток роговицы глаза кролика линии SIRC (Коллекция культур клеток позвоночных). Клетки линии HEp-2 и SIRC культивировали в среде ДМЕМ/F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; FBS HyClone) и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина в атмосфере 5% СO2. Фибробласты культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% ЭТС. Клетки высевали на поверхность 96-луночных планшетов с плотностью 20 тыс.кл/см2 и через 12 часов проводили облучение.  Число параллельных экспериментов составляло не менее трех.

Определение жизнеспособности клеток проводили через сутки после облучения на микроскопе Axiovert 200 (Карл Цейс, Германия) с использованием окрашивания клеток набором L-7007 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen), в который  входят два флуоресцентных красителя: SYTO 9 и иодид пропидия.  Исследование метаболической активности клеток проводили с использованием МТТ-теста по методике, опубликованной ранее [1]. Обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента, статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты исследования

Спектры возбуждения и эмиссии растворов квантовых точек измеряли в диапазоне длин волн от 300 до 800 нм (Рис. 1).

Рис1АА

Рис1ББ

Рисунок 1. Спектры возбуждения (А) и эмиссии (Б) квантовых точек CdSe/CdS в  полиметилфенилсилоксане (ПФМС).

Для КТ характерна широкая полоса возбуждения флуоресценции, простирающаяся от УФ (300 нм) до красной области оптического спектра, и узкая симметричная полоса эмиссии в области 580-660 нм. Это позволяет получать люминесцентное  излучение в оранжево-красном диапазоне при возбуждении не только ультрафиолетом, но и светом в видимой области спектра [2].

Проведенное исследование воздействия светового потока на жизнеспособность культуры фибробластов линии NIH 3Т3 показало, что воздействие света ксеноновой лампы (группа СС) приводит к зависимому от дозы облучения фотоповреждению клеток (Рис.2).

 

Рисунок 2. Жизнеспособность фибробластов 3T3 clone NIH при различных временах облучения: 1) 2 сек; 2) 50 сек; 3) 150 сек; 4) 600 сек; 5) 1200 сек; 6) 1800 сек.

*-достоверные различия с ПСС с СС-УФ (p ≤ 0,05; t-test). M±SEM.

При дозах облучения 0,3-19 Дж/см2 не наблюдается значимого различия в защитном действии материалов, отрезающих УФ-компоненту (СС-УФ), и материалов с квантовыми точками (ПСС). Однако, при повышении дозы облучения с 77 Дж/см2 до 231 Дж/см2 материалы, отрезающие УФ-компоненту, не справляются с защитой клеток, в то время как материалы с добавлением КТ полностью защищают клетки, оказывая даже незначительное стимулирующее воздействие по сравнению с интактным контролем, принятым за 100% (p ≤ 0,05). Эти данные показывают, что воздействие небольшой по интенсивности люминесцентной компоненты света оранжево-красного диапазона приводит к стимуляции внутриклеточных процессов, что приводит к  повышению жизнеспособности клеток. Эти данные подтверждают  гипотезу о биостимулирующем воздействии красного света [4].

Протекторный эффект от повреждающего действия солнечного света также был показан и на других типах клеток: эпителиальных клетках линии HEp2 и клетках роговицы глаза кролика SIRC (рис. 3).

 

Рисунок 3. Жизнеспособность клеток линий HEp2 и SIRC (1800 сек облучения):

1) СС - 231 Дж/см2; 2) СС-УФ – 38,4 Дж/см2; 3) ПСС – 39,9 Дж/см2.

*-достоверные различия с ПСС с СС-УФ (p ≤ 0,05; t-test). M±SEM.

Внешний вид клеток, облученных солнечным светом в присутствии и в отсутствие фильтров, представлен на рис. 4. Флуоресцентный краситель SYTO 9 окрашивает все клетки в зеленый цвет, иодид пропидия окрашивает ядра погибших клеток в красный цвет, что позволяет подсчитать процент гибели клеток под воздействием облучения.

Контроль

А

В

СС

А

В

СС-УФ

А

В

ПСС

А

В

Рисунок 4. Внешний вид фибробластов линии 3T3 clone NIH. Флуоресцентное окрашивание  SYTO 9 (А) и  иодидом  пропидия (В). Линейка 100 мкм

1) СС - 231 Дж/см2; 2) СС-УФ – 38,4 Дж/см2; 3) ПСС – 39,9 Дж/см2.

Исследование показало, что максимальная гибель клеток (89%) наблюдается при воздействии света ксеноновой лампы (группа СС). При использовании экрана, отрезающего УФ-компоненту, количество мертвых клеток снижается до 36% (группа СС-УФ). При облучении преобразованным светом с дополнительной люминесцентной компонентой (группа ПСС) количество мертвых клеток такое же, как и в контроле (6% и 3% соответственно).

Вывод

Проведенное нами исследование показало, что наличие даже небольшой по интенсивности дополнительной люминесцентной компоненты (λмакс=626нм) в спектре солнечного света приводит к стимуляции внутриклеточных процессов и возможному повышению регенераторных возможностей организма. Светопреобразующие материалы позволяют использовать солнечный спектр для возбуждения квантовых точек и формирования дополнительной люминесцентной компоненты с λмакс=626нм, таким образом  можно говорить о возможности применения данных материалов в новой  технологии фототерапии, являющейся  альтернативой использованию лазеров и светодиодов.

 

Спектроскопические измерения выполнялись при поддержках стипендии Президента (СП-6350.2013.4) и гранта РФФИ (14-44-03672). Определение жизнеспособности и метаболической активности клеток проводили при поддержке РНФ (14-25-00055).

 

Рецензенты:

Гапеев А.Б., д.ф-м.н., проф., ФГБУН Институт биофизики клетки РАН,  г.Пущино;

Белова Н.А., д.б.н., ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г.Пущино.