Проблема синтеза и изучения различных антимикробных и антигрибковых средств изучается достаточно давно. При этом подробно рассматриваются их основные группы, механизмы действия, а также механизмы устойчивости микроорганизмов к этим препаратам. Учеными обсуждаются принципы выбора антимикробных средств, комбинированная антимикробная терапия и антимикробная профилактика, приводятся теоретические основы и даются практические рекомендации, касающиеся рационального применения антимикробных средств. Но, несмотря на огромное количество уже известных антимикробных и антигрибковых средств, проблема синтеза и изучения активности все новых соединений обладающим подобным действием не утратила актуальности. Это объясняется еще и тем, что микроорганизмы (а также и грибы) обладают таким свойством, как приобретенная резистентность к антимикробным средствам.
Нами уже было начато фармакологическое изучение некоторых пирролохинолинов, которое осуществлялось с применением тестов, позволяющих выявить их психотропную, противосудорожную, анальгетическую и антисеротиновую активность [2]. Полученные результаты дают нам возможность утверждать, что данные соединения, а также их аналоги в той или иной степени обладают биологической активностью. Поэтому подробное и полное изучение данного направления является перспективным и актуальным. Не меньший интерес для фармакологии имеют и витаминоподобные соединения. Известно, что пирролохинолиновые аналоги витамина PQQ представляют собой биологически активные соединения, которые могут служить заменой природного соединения, то есть метоксатина, а, следовательно, оказывать воздействие на живые системы [1].
Результаты исследования показали, что 6-гидрокси-2,3-диметил-6-трифторметил-6,7,8,9-тетрагидро-1H-пирроло [3,2-h]хинолин-8-он проявил широкий спектр противомикробной активности, как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных микроорганизмов [5].
Известно, что микобактерии отличаются сложным строением клеточной мембраны, препятствующей проникновению терапевтических агентов, существованием латентных «дремлющих» форм, а также способностью вырабатывать резистентность. Поэтому, несмотря на усилия многочисленной армии исследователей во всем мире, в настоящее время задача поиска новых антитуберкулезных препаратов остается нерешенной. Это приводит к тому, что туберкулез занимает первое место в структуре смертности больных с инфекционными заболеваниями [3].
Цель исследования - изучение противотуберкулёзной активности 6-гидрокси-2,3-диметил-6-трифторметил-6,7,8,9-тетрагидро-1H-пирроло[3,2-h]хинолин-8-она.
Материалы и методы исследования
В соответствии с законом РФ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (1991г.), Федеральными санитарными правилами «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами» (СП 1.2.731 - 99), Инструкцией «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности» (СП 1.2.036 - 1995) к работе с материалом, зараженным туберкулезными и нетуберкулезными микобактериями (III-IV группы), допускаются лаборатории, имеющие специальное разрешение Центра Государственного санитарно-эпидемиологического надзора и нормирования Минздрава РФ [4]. Поэтому все работы по исследованию чувствительности микобактерий к исследуемому препарату проводились в ГКУЗ РМ «РПТД».
Исследуемое соединение использовали в виде раствора. В качестве растворителя применяли «Димексид» (концентрат для приготовления растворов для наружного применения, производство ОАО «Марбиофарм).
Для определения противотуберкулезной активности исследуемого соединения использовали метод абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. Этот метод традиционно используется в практике противотуберкулёзных учреждений для определения лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулёзным препаратам. Тест на лекарственную чувствительность проводили согласно приказу МЗ РФ от 21 марта 2003 года N 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». В опыте использовали клинические штаммы M.tuberculosis (МТБ) многократно проверенные и чувствительные ко всем противотуберкулезным препаратам. Из культуры МБТ готовили бактериальную суспензию, которая была стандартизирована по оптическому стандарту мутности № 5 (500 млн микробных тел в 1 мл). Далее готовили «рабочий» раствор путём разведения исходной суспензии в 10 раз стерильным физиологическим раствором (получили 5Х107 микробных тел в 1 мл). Затем осуществляли посев МБТ из «рабочего» раствора в пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, в которые был добавлен 6-гидрокси-2,3-диметил-6-трифторметил-6,7,8,9-тетрагидро-1H-пирроло [3,2-h] хинолин-8-он в различных концентрациях (3,8 мг/мл; 1,9 мг/мл; 0,95 мг/мл; 0,48 мг/мл; 0,24 мг/мл). Параллельно данную культуру микобактерий туберкулёза высевали на серию приготовленной питательной среды с эквивалентными объемами растворителя («Димексид») и в контрольные пробирки со средой Левенштейна-Йенсена без добавления других субстратов. Инкубирование проводили в течение 3-4 недель в термостате при температуре 37 ºС при обязательном еженедельном просмотре. Результаты определения учитывали на 21 день после посева. Характер действия определяли по наличию и интенсивности роста МБТ.
Результаты исследования и их обсуждение
На питательных средах с различными концентрациями (3,8 мг/мл; 1,9 мг/мл; 0,95 мг/мл; 0,48 мг/мл; 0,24 мг/мл) исследуемого соединения, роста МБТ не зафиксировано. В пробирках с эквивалентными объёмами растворителя и в пробирках без препарата наблюдался обильный рост МБТ. Полученные данные представлены в таблице.
Таким образом, 6-гидрокси-2,3-диметил-6-трифторметил-6,7,8,9-тетрагидро-1H-пирроло [3,2-h] хинолин-8-он в исследуемых концентрациях полностью подавил рост МБТ используемого клинического штамма МБТ. Минимальная концентрация, используемая в исследовании, составила 0,24 мг/мл 6-гидрокси-2,3-диметил-6-трифторметил-6,7,8,9-тетрагидро-1H-пирроло [3,2-h] хинолин-8-она.
Рост МБТ на среде Левенштейна-Йенсена
Состав среды |
Рост колоний МБТ |
Среды с исследуемым препаратом в концентрации: 3,8 мг/мл 1,9 мг/мл 0,95 мг/мл 0,48 мг/мл 0,24 мг/мл |
_ _ _ _ _ |
Среда с Димексидом |
+ |
Контроль (среда, не содержащая препаратов) |
+ |
*Примечание: «-» - отсутствие роста; «+» - наличие роста микобактерий, более 20 колоний.
Вывод
Таким образом, проведённое исследование показало, что 6-гидрокси-2,3-диметил-6-трифторметил-6,7,8,9-тетрагидро-1H-пирроло [3,2-h] хинолин-8-он способен подавлять рост и размножение микобактерий туберкулеза, что открывает возможности для его дальнейшего изучения.
Статья подготовлена в рамках проекта 2.2.2. Решение комплексных проблем в области биологии, экологии, химии, физиологии, спортивной медицины на базе НОЦ и НИЛ Программы стратегического развития МордГПИ на 2012-2016 гг.
Рецензенты:
Кадималиев Д.А., д.б.н., профессор кафедры биотехнологии, биоинженерии, биохимии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева», г. Саранск.
Сипров А.В., д.м.н., профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии с курсом фармацевтической технологии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева», г. Саранск.