В связи с широким распространением и повсеместным использованием инсектицидов на основе энтомопатогенной бактерии B. thuringiensis, а также внедрением в производство растений, модифицированных геном токсинообразования, значительно возросла биодоступность токсина [7, 8]. Потребность в препаратах на основе споровокристаллических комплексов бактерии B. thuringiensis для защиты сельскохозяйственной продукции от разных вредителей увеличивается с каждым годом, так как они экологически наиболее безопасны и эффективны по сравнению с химическими методами [2, 3]. По оценке экспертов, генетически модифицированные источники содержат уже 80% овощных консервов, 70% мясных продуктов и кондитерских изделий, 50% фруктов и овощей, 20% молочных продуктов и 90% пищевых смесей для детей. Сегодня в мире 18 стран выращивают трансгенную продукцию. В России выращивание трансгенных культур официально запрещено, а импорт генно-модифицированных продуктов разрешен [1].
В связи с выше сказанным неизбежно попадание токсина в организм животных и человека. В настоящее время появляется все больше публикаций, особенно в зарубежной литературе, о неблагоприятных последствиях для здоровья человека применения биопрепаратов на основе B. thuringiensis [6, 9]. Таким образом, особо актуальной на данный момент является всесторонняя оценка действия дельта-эндотоксина B. thuringiensis на теплокровных животных.
Цель исследования
Целью данного исследования явилась оценка влияния дельта-эндотоксина на активность трансаминаз в сыворотке крови, продолжительность жизни и массу тела лабораторных животных. На основании результатов исследования активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови можно сделать заключение о характере изменений, происходящих внутри клеток тканей и выявить нарушения в работе органов, т.к. именно эти ферменты способны выходить в межклеточное пространство в результате нарушения целостности клеточных мембран [5].
Материал и методы исследования
Материалом исследования послужили 40 беспородных белых крыс, которых в возрасте 240 суток разделили на контрольную и три (I, II, III) опытные группы. Исследуемый период постнатального онтогенеза включает фазы стабильного и регрессивного роста животных, характеризующиеся отсутствием в тканях органов массового деления клеток и увеличения их размеров, относительным постоянством линейных размеров и массы тела, а также интенсивным накоплением жировых запасов и преобладанием процессов диссимиляции над ассимиляцией [4].
Животным I, II и III опытных групп ежедневно в течение 3 месяцев перорально с пищей вводили раствор кристаллов дельта-эндотоксина из расчета 4 мг/кг массы животного, 8 мг/кг и 16 мг/кг соответственно. В работе использовали штамм 617 подвида B. thuringiensis subsp. sotto, полученный из ФГУП ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Поверхностное культивирование осуществляли в термостатах при 27оС в чашках Петри на агаризованной питательной среде РПА, рН=7,2–7,5. Биомассу B. thuringiensis, содержащую кристаллы эндотоксинов и споры продуцента, отмывали дистиллированной водой от компонентов питательной среды и водорастворимых токсинов. Кристаллы предварительно выделяли в чистом виде, используя двухфазную систему: 1% водный раствор сульфата натрия – четыреххлористый углерод. При этом кристаллы переходили в водную фазу, из которой их осаждали центрифугированием. Щелочную экстракцию дельта-эндотоксина выполняли по методу Кукси. Затем раствор подвергали диализу и доводили водой до необходимой концентрации. Очистку дельта-эндотоксинов завершали микрофильтрацией через бактериальные фильтры (диаметр пор 0,4 мкм). В экспериментах использовали свежеприготовленные растворы дельта-эндотоксина. Уровень белка определяли по методике Лоури.
Для биохимического исследования сывороток крови экспериментальных животных использовали наборы: «ЛДГ-Олвекс Диагностикум» (для определения активности ЛДГ оптимизированным кинетическим методом), «АсАТ-15- Олвекс Диагностикум» (для определения активности АсАТ энзиматическим кинетическим методом) и «АЛТ-1-Олвекс Диагностикум» (для определения активности АлАТ диагностическим энзиматическим кинетическим методом). Активность ферментов выражали в Ед/л, где Ед – единица активности фермента, предусмотренная диагностическим тестом. Взвешивание животных проводилось еженедельно перед утренним кормлением с помощью лабораторных электронных весов ВМ 153М. Полученные данные подвергали статистической обработке с определением критерия значимости (Т) по Стьюденту, уровень значимости был принят р<0,05. Все эксперименты на животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза от 13.11.1984 г. №724) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе исследования было установлено, что активность ЛДГ в сыворотке крови у животных I и II групп составляет 2887,5±197,72 Ед/л и 3550±158,11 Ед/л соответственно. Тогда как у животных контрольной группы этот показатель составляет 4740±304,76 Ед/л, а у животных III опытной группы - 4400±228,04 Ед/л (рис. 1).
- достоверные отличия от контрольных значений (р<0,05)
Рис. 1 Активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови животных экспериментальных групп
Снижение активности данного фермента у животных I и II групп указывает на увеличение аэробности условий, которое было вызвано действием дельта-эндотоксина. Переход в присутствии кислорода от анаэробного гликолиза к дыханию, обеспечивает переключение клетки на наиболее эффективный и экономичный путь получения энергии.
При этом активность другого фермента – АсАТ – в сыворотке крови у животных всех опытных групп значительно ниже, чем у животных контрольной группы (рис. 2).
- достоверные отличия от контрольных значений (р<0,05)
Рис. 2 Активность аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови животных экспериментальных групп
Активность АсАТ в сыворотке крови у животных контрольной группы составляет 15,8±1,34 Ед/л, тогда как у животных I, II и III опытных групп - 7,44±1,5 Ед/л, 10,2±2,1 Ед/л и 6,44±1,6 Ед/л соответственно. Следовательно, снижение активности АсАТ в сыворотке крови у животных опытных групп происходит в 2, 1,5 и 2,5 раза по сравнению с таковым показателем у животных контрольной группы.
В литературе имеются данные о том, что повышенные значения активности ферментов крови являются нормой для процесса старения [10]. Таким образом, наблюдаемое снижение активности ферментов в сыворотке крови у животных одного и того же возраста во всех опытных группах может свидетельствовать об уменьшении степени разрушения клеток под действием дельта-эндотоксина B. thuringiensis.
В активности АлАТ не было отмечено достоверных отличий между животными экспериментальных групп. Все значения активности фермента, полученные в каждой группе животных, являются физиологически нормальными для белых крыс (рис. 3). Этот факт согласуется с литературными данными об отсутствии влияния возрастных изменений в организме на активность данного фермента.
Рис. 3 Активность аланинаминотрансферазы в сыворотке крови животных экспериментальных групп
При пероральном введении крысам дельта-эндотоксина B. thuringiensis в общем состоянии животных опытных групп не было отмечено каких-либо особенностей. Их внешний вид, состояние шерстного покрова, активность потребления корма и воды не отличались от животных контрольной группы.
Анализ данных проведенного нами исследования показал, что продолжительность жизни животных III опытной группы была достоверно на 4% выше таковой животных контрольной и I, II опытных групп (таблица 1). Примечательно, что в конце эксперимента средняя масса животных I группы на 11%, II и III групп на 13% превышала массу животных контрольной группы. Сохранение массы тела у животных опытных групп мы склонны рассматривать как результат замедления развития атрофических процессов в мышечной ткани взрослых животных.
Таблица 1
Продолжительность жизни и увеличение средней массы животных контрольной и опытных групп
|
Группа животных
|
Продолжительность жизни (сутки) |
Средняя масса животных в конце эксперимента, г |
Превышение массы тела животных опытных групп по отношению к контрольным животным, % |
|
Контрольная |
342±2 |
298,29±2,31 |
|
|
I опытная |
344±3 |
335,16±5,3* |
11 |
|
II опытная |
345±2 |
342,3±6,35* |
13 |
|
III опытная |
360±5* |
342,43±7,76* |
13 |
* - достоверные отличия от контрольных значений (р<0,05)
Заключение
Приведенные данные свидетельствуют о том, что пероральное введение дельта-эндотоксина B. thuringiensis оказывает существенное влияние на активность ЛДГ и АсАТ в сыворотке крови белых крыс, а также на продолжительность их жизни и массу. Наблюдаемое снижение активности ферментов в сыворотке крови у животных всех опытных групп под действием дельта-эндотоксина B. thuringiensis может свидетельствовать об уменьшении степени разрушения клеток с возрастом. Сохранение массы тела у животных опытных групп мы склонны рассматривать как результат замедления развития атрофических процессов в мышечной ткани взрослых животных.
Полученные результаты не выявили токсического воздействия (прямого) дельта-эндотоксина данного подвида на млекопитающих. Его можно рассматривать скорее как благоприятное, в пользу чего свидетельствует снижение активности ЛДГ и АсТ, а также влияние на продолжительность жизни и массу тела.
Рецензенты:
Гондарева Л.Н., д.б.н., профессор кафедры физиологии труда и спорта ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск;
Чураков Б.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой лесного хозяйства ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск.