Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

TO THE QUESTION OF MELATONIN INJECTION EFFICIENCY IN THE CORRECTION OF PATHOLOGICAL CHANGES IN THE RAT TESTIS AFTER EPIPHYSECTOMY

Slesareva E.V. 1 Slesarev S.M. 1 Arav V.I. 1 Lyapeykova O.V. 1 Alimova R.I. 1 Nurtdinova G.I. 1
1 Ulyanovsk State University
Проведен анализ влияния введения мелатонина на возможность коррекции циркадных нарушений, возникающих в паренхиме семенников крыс после эпифизэктомии. Эпифизэктомия выполнялась по авторской методике. Одной группе животных подкожно вводили мелатонин (10мг/кг) во время смены световой фазы фоторежима на темновую в течение 14 суток. Контролем послужили группы интактных и эпифизэктомированных животных. На парафиновых срезах, после окрашивания ШИК-реакцией определяли активность сперматогенеза и эндокринной ткани семенников. Указанные параметры изучали каждые 3 часа на протяжении двух суток (для выявления циркадианного ритма). Ведение мелатонина по указанной схеме не позволило сформировать суточные ритмы активности сперматогенеза и эндокринной ткани в семенниках, утраченные после эпифизэктомии. Непосредственно после введения наблюдалось непродолжительное антипролиферативное действие мелатонина на сперматогонии. Отсутствие эффекта введения мелатонина по указанной схеме может рассматриваться как обоснование необходимости разработки форм и способов обеспечения пролонгированного действия мелатонина.
We analyzed the influence of melatonin injection on the possibility of circadian disorders correction, which occurring in the parenchyma of the rat’s testes after epiphysectomy. The epiphysectomy was performed by the autor’s method. One group of animals was subcutaneously injected with melatonin (10 mg/kg) during the shift photo mode phase from light to dark conductivity for 14 days. The intact and epiphysectomy animals had been accepted as the control group. The activity of spermatogenesis and endocrine tissue of the testeswas determined after staining with PAS-reaction on paraffin sections. These parameters were studied every 3 hours during two days (to identify circadian rhythm). This scheme of melatonin injection didn’t allowed to generate circadian rhythms of activity in spermatogenesis and endocrine tissue in testes, which had been lost after epiphysectomy. The antiproliferative melatonin effect on spermatogonia had been observed immediately after the injection during the short time. The lack of melatonin injection effect by thysscheme can be considered as a justification for the development of the forms and methods to ensure the prolonged action of melatonin.
spermatogenesis
circadian rhythm
melatonin
Leydig cells

В последние десятилетия эпифизарный гормон мелатонин подвергался многочисленным и всесторонним исследованиям. Экспериментально установлены синхронизирующие свойства мелатонина в организации циркадианного ритма двигательной активности [5], ритма сна-бодрствования [1], показаны его свойства как протектора ДНК и сильного антиоксиданта [4, 6]. Тот факт, что мелатонин является необходимым звеном регуляции циркадианных ритмов различных функций организма, позволяет предполагать его участие и в регуляции функционирования мужских гонад. Последнее должно осуществляться непосредственным или опосредованным влиянием мелатонина на процессы репродукции, дифференцировки и функционирования сперматогенных и эндокринных клеток семенников. Однако вопрос о роли мелатонина в регуляции активности мужских гонад остается открытым. В предыдущих работах мы показали патоморфологические изменения, возникающие в гонадах после эпифизэктомии [3]. Целью настоящей работы явилось исследование компенсаторных возможностей паренхимы семенников эпифизэктомированных белых крыс на фоне введения мелатонина.

Материалы и методы. Опыты выполнены на 270 самцах беспородных белых крыс массой 160-200г. Животные в течение 20 дней адаптировались к режиму освещенность: темнота=12:12 (освещение с 6 до 18 ч). На всем протяжении опыта доступ к пище и воде был свободным. По истечении адаптационного периода крысы были разделены на три экспериментальные группы: интактные контрольные (n=90), эпифизэктомированные (n=90), эпифизэктомированные с последующим введением мелатонина (n=90). Все эксперименты, уход и содержание животных осуществлялось в соответствии с Дерективой №63 от 22.09.10г. Президиума и Парламента Европы «О защите животных, используемых для научных исследований». Животным 2 и 3 группы была проведена операция эпифизктомии по оригинальной методике [2].

Животным 3 группы ежедневно с 26-го по 41-й день после эпифизэктомии в 18 часов (время смены фоторежима со световой фазы на темновую) подкожно вводили свежеприготовленный раствор мелатонина (в дозе 10мг/кг), что моделировало ночной подъем уровня мелатонина в крови. Забор гистологического материала производили на 40 – 41-й день после эпифизэктомии через каждые три часа в течение двух суток, что обеспечивало исследование функциональной активности семенников на протяжении двух периодов циркадианного ритма.

Семенники фиксировали в жидкости Карнуа и готовили парафиновые срезы 5-6мкм по стандартной гистологической методике. Срезы окрашивали реакцией с Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция), ядра клеток доокрашивали гематоксилином Майера. У животных каждой группы определяли абсолютную массу семенников (г), суточную динамику митотического индекса сперматогоний промежуточного типа и типа Б (‰), частоту встречаемости метафазы мейоза и спермиации (‰), количество активных клеток Лейдига на 1000 клеток интерстиция, общую функциональную активность перитубулярных эндокриноцитов (суммарная площадь сечения ядер всех выявленных активных эндокриноцитов из 1000 клеток интерстиция) в каждой временной точке.

Для всех параметров при статистической обработке вариационных рядов вычислялись значения средней арифметической взвешенной (М), ошибки средней арифметической взвешенной (m). Достоверность различий между показателями оценивалась t-критерием Фишера-Стьюдента. Уровень значимости различий был принят р<0,05. Для оценки наличия ритма применяли регрессионный анализ методом наименьших квадратов и спектрального анализа.

Результаты исследования и их обсуждение. После введения мелатонина эпифизэктомированным самцам белых крыс однократно в течение суток на протяжении двух недель общая организация семенников морфологически не отличалась от интактных и эпифизэктомированных животных. Во всех извитых семенных канальцах сохранялся активный сперматогенез (рис. 1).

Рис. 1. Извитые семенные канальцы на стадии спермиации у эпифизэктомированных белых крыс после введения мелатонина. Окрашивание: ШИК-реакция, с доокраской ядер гематоксилином, увеличение х 400. Наблюдается выход сперматозоидов в просвет извитого семенного канальца

Площадь, занимаемая интерстицием, составила 9,84±3,14% от общей площади поперечного сечения семенника. По сравнению с интактными и эпифизэктомированными животными достоверного изменения соотношения сперматогенная/эндокринная ткань не наблюдалось, что свидетельствует о сохранении среднего уровня активности течения сперматогенеза. Количественное отношение и взаимное расположение сперматогенных клеток не отличалось от группы интактных контрольных животных, в каждом извитом канальце определялись цитологический профиль и стадия сперматогенного цикла.

Однократные в течение суток инъекции мелатонина подавляли высокую митотическую активность сперматогоний, наблюдавшуюся после эпифизэктомии только на короткое время, а затем митотический индекс достигал прежних, высоких значений. Среднесуточный уровень митотической активности сперматогоний промежуточного типа превышал значения интактных животных на 9,2%, сперматогоний типа Б – на 18,8 %. При графически-параметрическом анализе суточной динамики митотического индекса сперматогоний изученных типов в данной экспериментальной группе отмечалось отсутствие циркадианных ритмов (рис. 2).

Сглаженная кривая динамики митотической активности сперматогоний промежуточного типа характеризовалась кривой без ритмических колебаний и не обнаруживала связи со свето-темновым циклом (рис. 2). Активные фазы наблюдались как в светлое, так и в темное время суток. Максимальные значения показателей фиксировались в 24ч, 9ч и 15 ч первых суток, 24ч, 6ч и 12ч вторых суток эксперимента. Абсолютная амплитуда составила 38,32‰, что практически не отличалось от показателей у интактных животных. Средние значения митотического индекса в ночные и дневные часы достоверно не различались.

Рис.2. Суточная динамика митотической активности сперматогоний промежуточного типа эпифизэктомированных белых крыс после введения мелатонина

Обработка полученных данных методом спектрального анализа показала наличие колебаний с периодом 24 ч для сперматогоний промежуточного типа, однако амплитуда колебаний была незначительна. Для сперматогоний типа Б выявлены колебания с периодом 17 ч, что характерно для ультрадианного ритма. Анализ митотической активности сперматогоний методом наименьших квадратов выявил наличие ультрадианного ритма митотической активности с периодом 19 ч и инфрадианного ритма с периодом 33,5 ч для сперматогоний промежуточного типа. То есть, циркадианный ритм, выявленный методом спектрального анализа, не подтвердился другими методами математического и графического анализа.

При определении суточной динамики частоты встречаемости этапов мейотического деления сперматоцитов и спермиации в группе эпифизэктомированных крыс с введением мелатонина также отмечалось исчезновение циркадианных ритмов их встречаемости.

Таким образом, ежесуточное введение мелатонина эпифизэктомированным животным в течение двух недель не привело к формированию суточных ритмов течения сперматогенеза. Показатели течения сперматогенеза, изученные в данной группе, практически не отличались от показателей в группе эпифизэктомированных животных.

Введение мелатонина эпифизэктомированным животным не повлияло на среднесуточное количество активных клеток Лейдига (760,47±4,89). Суточная динамика, как и в группе эпифизэктомированных животных, характеризовалась кривой без определенной взаимосвязи со свето-темновым циклом (рис.3). Абсолютная амплитуда колебаний составила 58,16 единиц, что превышало значения у интактных и эпифизэктомированных животных. Средние показатели в темное и светлое время суток не имели достоверных различий (752,92±9,19 и 763,17±5,73 соответственно, р>0,05). Метод спектрального анализа не выявил периодических колебаний количества активных гландулоцитов в течение суток. Ультрадианный ритм с периодом 6,5 ч выявлен только методом наименьших квадратов.

Суточная динамика суммарной площади сечения ядер активных клеток Лейдига в группе эпифизэктомированных животных, получающих ежесуточно мелатонин, также не имела циркадианной ритмичности. Профили синусоиды, на графике суточной динамики не имели связи со свето-темновым циклом, достоверное повышение активности наблюдалось только во вторые сутки эксперимента, причем как в темное, так и в светлое время суток (24ч и 12ч соответственно) (рис.3). Амплитуда колебаний составила 4096,83 единиц (22,65%). Средние значения в светлое время не отличались от значений, полученных для темного времени суток (15476,94±640,38 мкм2 и 15819,67±474,77мкм2 , р>0,05).

Рис. 3. Суточная динамика количества активных клеток Лейдига и суммарной площади сечения их ядер у эпифизэктомированных белых крыс после введения мелатонина

Математические методы анализа временной динамики активности гландулоцитов семенника также не выявили циркадианной ритмичности изучаемых показателей. Так, метод спектрального анализа показал отсутствие каких-либо ритмических колебаний. Методом наименьших квадратов определены только ультрадианные колебания с периодом 10,3 ч.

В настоящее время мелатонин рассматривается как основной гормон эпифиза. Эффекты мелатонина показывают существенную зависимость от времени суток и сезона года, когда вводился препарат, а также от дозы, режима и способа введения. Регуляторное воздействие мелатонина на репродуктивную систему выявлено для некоторых моноэстричных животных, причем определяющими факторами в данном случае, помимо дозы и длительности введения, являлась фаза репродуктивного цикла, в которую вводился мелатонин. Так, введение мелатонина в вечернее время пальмовой белке вызывало угнетение активности семенников [7]. Показано, что медленное введение мелатонина (подкожный имплант) в течение 47-71 дней не изменяет качества спермы баранов, но увеличивает выработку тестостерона [8].

В проведенном нами исследовании мелатонин вводился при смене световой фазы фотопериода на темновую однократно в течение суток, что должно было смоделировать ночной подъем уровня мелатонина у интактных животных. Однако введение мелатонина эпифизэктомированным животным в нашем эксперименте не привело к восстановлению циркадианного ритма активности мужских гонад. Нарушения функции сохранялись как со стороны герминативной ткани семенников, так и со стороны эндокринной. Используемая нами схема введения мелатонина не обеспечила его длительный антипролиферативный эффект на сперматогонии. Имеются сведения, что после введения экзогенного мелатонина через рот или внутривенно он быстро метаболизируется в печени. Вероятно, однократное в течение суток введение мелатонина не позволило установить достаточный уровень концентрации гормона в крови вследствие его быстрого выведения, что и объясняет отсутствие эффекта мелатонина на формирование циркадианного ритма активности мужских гонад.

Заключение. Таким образом, однократное в течение суток введение мелатонина эпифизэктомированным животным на протяжении двух недель не позволило сформировать циркадианные ритмы течения сперматогенеза и активности эндокринной ткани семенников. Выявленные в этой группе параметры соответствовали показателям, полученным в группе эпифизэктомированных животных. Отмеченное выше отсутствие эффекта однократного в течении суток введения мелатонина на формирование циркадианного ритма пролиферации может рассматриваться как обоснование необходимости разработки форм и способов обеспечения пролонгированного действия мелатонина.

Рецензенты:

Говорухина А.А., д.б.н., зав. кафедрой медико-биологических дисциплин и безопасности жизнедеятельности, ведущий научный сотрудник Лаборатории «Здоровый образ жизни и охрана здоровья» Сургутского государственного педагогического университета, г. Сургут.

Смолькина А.В., д.м.н., доцент, профессор кафедры госпитальной хирургии, анестезиологии, реаниматологии, урологии, травматологии, ортопедии медицинского факультета им. Т.З. Биктимирова Института медицины, экологии и физической культуры ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск.