Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF DESMETHYLSIBUTRAMINE QUANTITATIVE DETERMINATION METHOD BY GLC-FID

Stern K.I. 1 Malkova T.L. 1
1 Perm State Pharmaceutical Academy
Статья посвящена проблеме неконтролируемого употребления сильнодействующих веществ (сибутрамина и его структурных аналогов, метаболитов десметилсибутрамина и дидесметилсибутрамина) в биологически активных добавках к пище. В научной литературе отсутствует какая-либо информация по контролю БАД на наличие сильнодействующих веществ, в то время как в практике судебно-химических исследований имеются факты обнаружения данных веществ в данных продуктах. В связи с этим возникла необходимость усовершенствования процедуры обнаружения сильнодействующих веществ методами качественного и количественного анализа. Разработана методика определения десметилсибутрамина методом газо-жидкостной хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием. Аналитическая область методики составила 10 – 1000 мкг/мл. Методика валидирована по показателям линейность, правильность, прецизионность и обладает хорошей воспроизводимостью. Данная методика может использоваться в соответствующих аналитических лабораториях.
The article deals with the problem of uncontrolled using of strong effective substances (sibutramine and its structural analogs, metabolites desmethylsibutramine and didesmethylsibutramine) in dietary supplements. There is no information about control of dietary supplements for the presence of strong effective substances in the scientific literature, while in the practice of forensic chemical research there are facts of these substances detection in these products. Therefore it was a necessary to improve procedures of detection of strong effective substances by qualitative and quantitative methods. The method of GLC-FID desmethylsibutramine determination is developed. Analytical range was 10 – 1000 µg/ml. The method is validated in terms of calibration curve, the accuracy, precision, and has a good reproducibility. This method can be used in the respective analytical laboratories.
validation
psychoactive substances
desmethylsibutramine
quantitative analysis
gas liquid chromatography

Проблема злоупотребления психоактивными веществами в России из года в год становится все более актуальной. В последнее время участились случаи обнаружения сибутрамина и его активных метаболитов (М1 и М2) в биологически активных добавках для похудения (БАД). Федеральная Служба РФ по контролю за оборотом наркотиков в Методических рекомендациях по криминалистическому исследованию сибутрамина от 2006 г. сообщала, что, с учетом дофаминовой теории формирования наркологических заболеваний, сибутрамин может вызывать привыкание и зависимость, а клинические описания его действия позволяют предположить использование его потребителями психоактивных веществ в качестве психостимулятора [4]. С 2008 года сибутрамин, а также его структурные аналоги, обладающие схожим психоактивным действием, включены в список сильнодействующих веществ для целей статьи 234 и других статей Уголовного кодекса Российской Федерации [3].

Сибутрамин метаболизируется изоферментом CYP3А4 до деметилированных метаболитов M1 и М2 (моно- и дидесметилсибутрамин), которые обуславливают его терапевтический эффект и являются структурными аналогами сибутрамина [6, 7, 8]. Установлено, что десметилсибутрамин (ДМС) и дидесметилсибутрамин (ДДМС) примерно в 100 раз активнее исходного соединения [5, 8].

Согласно действующему законодательству РФ, сильнодействующие вещества и их аналоги запрещены к использованию в составе БАД [2]. Ввиду сложившейся ситуации вопрос об усовершенствовании процедуры обнаружения посторонних токсикологически важных веществ, не заявленных в составе БАД, стоит достаточно остро. Однако на сегодняшний день в литературных источниках отсутствует какая-либо информация по процедуре контроля БАД на наличие сильнодействующих веществ, в то время как в практике судебно-химических исследований имеются факты обнаружения данных веществ в биологически активных добавках к пище.

Цель исследования

Разработка методики количественного определения активного метаболита сибутрамина, ДМС, методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ).

Материал и методы исследования

Субстанцию ДМС получали из содержимого капсул «Жуйдэмэн» (500 мг, № 60), содержащих данное вещество, при комнатной температуре следующим образом: содержимое капсул высыпали в чистую стеклянную склянку, залили спиртом этиловым 95% (1:10), встряхивали в течение 15 минут, затем надосадочную жидкость сливали в чистую стеклянную склянку. Оставшийся осадок вновь заливали спиртом этиловым 95% и операции повторяли. Надосадочные жидкости объединяли и выпаривали без нагревания до сухого остатка. Получившийся сухой остаток брался из расчета, что его состав соответствует экстракту содержимого одной капсулы. После перекристаллизации экстракт был проанализирован на газовом хроматографе Agilent 7890A с масс-спектрометром Agilent 5975C, в результате чего была идентифицирована и подтверждена его химическая структура: масс-спектр пика со временем удерживания 13,18 мин соответствовал библиотечному масс-спектру ДМС (рис. 1).

Рисунок 1. Хроматограмма перекристаллизованного экстракта (верхняя часть рисунка), масс-спектр пика с временем удерживания 13,18 мин (средняя часть рисунка) и библиотечный масс-спектр десметилсибутрамина (нижняя часть рисунка).

Готовили растворы ДМС в этиловом 96 % спирте в концентрациях 1 мг/мл, 500 мкг/мл, 200 мкг/мл, 100 мкг/мл, 50 мкг/мл и 10 мкг/мл. В качестве внутреннего стандарта использовали раствор метилстеарата в 96 % этиловом спирте в концентрации 1 мг/мл.

Исследование проводили на газовом хроматографе Хроматэк-Кристалл 5000 с пламенно-ионизационным детектором в следующих условиях: колонка HP-5MS, скорость потока газа-носителя (азот) 2,3 мл/мин, температура термостата колонки начальная 170 °С, конечная – 220 °С, температура детектора 250 °С, температура испарителя 230 °С, ввод пробы с делением потока 1/3, объем вводимой пробы 1 мкл, время хроматографирования 18 мин.

Результаты исследования и их обсуждение

Количественное определение ДМС осуществляли методом ГЖХ с расчетом концентрации по методу внутреннего стандарта, в качестве которого был выбран метилстеарат, преимуществами использования которого являются его хроматографические свойства, близкие к определяемому веществу, стабильность полученных результатов, и доступность для закупки на территории РФ.

Время удерживания ДМС и метилстеарата в заданных условиях хроматографирования составило 7,07 мин и 10,93 мин соответственно (рис. 2).

Рисунок 2. Хроматограмма раствора ДМС с внутренним стандартом (метилстеарат) в концентрации 1000 мкг/мл.

Валидацию разработанной методики осуществляли по показателям: линейность, правильность, прецизионность (на уровне intra-day и inter-day), аналитическая область [1].

Линейность

Для определения линейности проводили анализ 6 калибровочных спиртовых растворов ДМС с концентрациями от 10 мкг/мл до 1000 мкг/мл в присутствии внутреннего стандарта (1000 мкг/мл) (табл. 1).

Таблица 1

Значения концентраций калибровочных растворов и отношений площадей пиков ДМС к площадям пиков метилстеарата

СДМС, мкг/мл

СМС, мкг/мл

SДМС

SМС

SДМС/ SМС

Si

Sср

Si

Sср

Si

Sср

10

1000

49,919

46,512

8319,833

7752,000

0,0060

0,0060

45,663

7610,500

0,0060

43,954

7325,667

0,0060

50

1000

193,912

200,776

6002,845

6078,020

0,0323

0,0330

211,794

6310,256

0,0336

196,621

5920,958

0,0332

100

1000

303,652

405,149

5855,909

7692,778

0,0519

0,0526

489,749

9227,440

0,0531

422,047

7994,986

0,0528

200

1000

677,061

678,460

5732,946

5754,650

0,1181

0,1179

681,875

5808,131

0,1174

676,443

5722,872

0,1182

500

1000

1550,308

1870,566

5834,157

6914,314

0,2660

0,2703

2129,204

7808,231

0,2730

1932,187

7100,553

0,2720

1000

1000

3814,719

3619,324

6320,993

5998,512

0,6035

0,6034

3286,095

5446,867

0,6033

3757,157

6227,676

0,6033

*СДМС – концентрация десметилсибутрамина в растворе, СМС – концентрация метилстеарата в растворе,

SДМС – площадь пика ДМС, SМС – площадь пика метилстеарата.

По полученным значениям строили график линейной зависимости. Были рассчитаны коэффициенты регрессионной прямой у = 0,0006х методом наименьших квадратов, где у – среднее значение отношения площади пика ДМС к площади пика метилстеарата, рассчитанное по трем хроматограммам, х – концентрация ДМС, мкг/мл (Сфакт). (рис. 3).

Рисунок 3. Калибровочный график зависимости отношения площади пика ДМС к площади пика метилстеарата от концентрации ДМС в растворе

Квадрат линейного коэффициента корреляции (R2) характеризует степень соответствия между регрессионной моделью и исходными данными. В данном случае 99,68% изменений зависимой переменной описывается регрессионным уравнением. Коэффициент корреляции R = 0,9984, что свидетельствует о наличии прямой линейной зависимости между площадью пика ДМС и его концентрацией в растворе.

Правильность и прецизионность

Для оценки правильности и прецизионности методики проводили анализ 3 калибровочных спиртовых растворов ДМС с концентрациями 10 мкг/мл, 200 мкг/мл, и 1000 мкг/мл в течение первого дня (intra-day) и второго дня (inter-day). Каждый раствор хроматографировали в трех повторностях. Для полученных значений концентрации ДМС рассчитывали величину стандартного отклонения (SD), относительного стандартного отклонения (RSD, %) и отклонение от заданной величины (ε, %). Данные представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2

Оценка правильности и прецизионности (intra-day)

Сфакт, мкг/мл

Сизм, мкг/мл

Сср (n=3)

SD (n=3)

RSD, % (n=3)

ε, %

10

10,03

10,04

0,01

0,12

0,40

10,03

10,05

200

196,85

197,08

0,24

0,12

1,46

197,33

197,07

1000

1005,83

1005,61

0,19

0,02

0,56

1005,50

1005,50

*Сфакт – фактическая концентрация ДМС в растворе, Сизм – концентрация ДМС в растворе, рассчитанная по методике.

Таблица 3

Оценка правильности и прецизионности (inter-day)

Сфакт, мкг/мл

Сизм, мкг/мл

Сср (n=3)

SD (n=3)

RSD, % (n=3)

ε, %

10

9,87

9,91

0,05

0,52

0,90

9,90

9,97

200

195,33

195,61

0,56

0,29

2,19

195,25

196,25

1000

1007,83

1007,81

0,28

0,03

0,78

1007,52

1008,08

*Сфакт – фактическая концентрация ДМС в растворе, Сизм – концентрация ДМС в растворе, рассчитанная по методике.

Полученные значения RSD и ε свидетельствуют о достаточной степени соответствия между истинным значением определяемого вещества и его значением, рассчитанным по данной методике.

Аналитическая область методики

Аналитическая область методики на основании результатов оценки линейности, правильности и прецизионности составила 10 – 1000 мкг/мл.

Заключение

Разработана методика количественного определения десметилсибутрамина методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационной детекцией, обладающая необходимой линейностью, правильностью и прецизионностью, что позволяет говорить о хороших валидационных характеристиках данной методики.

Рецензенты:

Вихарева Е.В., д.фарм.н., доцент, заведующий кафедрой аналитической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь;

Ярыгина Т.И., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической химии факультета очного обучения ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь.