Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

PRESENCE OF THE RF1 GENE IN CONFECTIONERY SUNFLOWER VARIETIES OF THE VIR COLLECTION

Pepelyaeva E.A. 1 Anisimova I.N. 2 Gavrilova V.A. 2 Rozhkova V.T. 3 Novoselova L.V. 1
1 The Perm State National Research University
2 N.I.Vavilov Research Institute of Plant Industry
3 Kuban Experiment Station of VIR
Проведен анализ 34 образцов крупноплодного подсолнечника коллекции ВИР на наличие в них маркера гена Rf1 для создания родительских форм гибрида кондитерского направления. В результате исследования подтверждено наличие SCAR-маркера Y10 среди сортов крупноплодного подсолнечника. Исследованные образцы были условно распределены в 4 группы: 1 группа – с содержанием маркера гена Rf1 у более 50% исследованных растений; 2 группа – наличие маркера у 20-50% растений, 3 группа – наличие маркера у 10-20% растений и 4 группа, у растений которой маркер не был обнаружен. Во вторую группу образцов отнесены такие сорта, как СПК, Лакомка, Бородинский, Донской крупноплодный. В первую группу отнесены 9 образцов, причем у трех образцов количество растений с наличием маркера составляет более 90%.
With the purpose of creation of parental forms for a confectionary hybrid variety the thirty three large-seed sunflower accessions of the VIR collection were analyzed for the presence of the Rf1 gene marker. As a result of research the presence of the SCAR-marker Y10 among the studied confectionery sunflower varieties is confirmed. The examined accessions were conventionally divided into 4 groups. In the first group the marker was present in more than 50% of the studied of plants. In the second the marker was found in 20-50% of the plants. In the third group the marker was observed in 10-20% of the plants, and in the fourth group all the plants were without marker. The second group includes accessions SPK, Lakomka, Borodinskiy, Donskoy krupnoplodnyi. The first group included 9 accessions and the three of them the of plants with the marker constituted more than 90%.
sunflower
breeding
confectionery
fertility restoration
molecular marker
Введение

Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) широко распространена среди высших растений. Это явление заключается в неспособности растения продуцировать жизнеспособную пыльцу, тогда как женская генеративная сфера остается в норме. Различные системы ЦМС - Rf имеют принципиальное значение при производстве гибридных семян различных культур (подсолнечника, риса, сахарной свеклы, рапса и других), так как они обеспечивают проведение контролируемого опыления материнских стерильных линий пыльцой отцовских форм без трудоемкой ручной кастрации [7].

Мужская фертильность может быть восстановлена ядерными генами восстановления фертильности пыльцы Rf-генами (Restoration of fertility). К настоящему времени у подсолнечника (Helianthus annuus) описаны более 70 источников ЦМС, каждый из которых требует присутствия в геноме определенных генов восстановления фертильности. Однако все современные промышленные гибриды подсолнечника созданы на основе одного источника ЦМС РЕТ1, полученного Леклерком из межвидового гибрида H. petiolaris × H. аnnuus.  Митохондральная ДНК форм с цитоплазматической мужской стерильностью (мтДНК РЕТ1) отличается от мтДНК фертильных форм наличием инверсии 11 т.н. и инсерции 5 т.н., приводящих к появлению новой открытой рамки считывания orfH522, ко-транскрибируемой вместе с геном atpA и кодирующей белок 16 кДа. Мужской фертильный фенотип может быть восстановлен путем введения в генотип гибрида доминантного ядерного гена Rf, который вызывает снижение уровня ко-транскрипта atpA-orfH522 в пыльниках в течение мейоза и дальнейшее снижение количества белка ORFH522. По различным данным, для восстановления фертильности пыльцы форм подсолнечника с ЦМС PET1 необходимо от одного до четырех генов. Показано, что один из генов, необходимых для восстановления фертильности форм с ЦМС РЕТ1, присутствует в генотипе большинства линий ЦМС и линий-закрепителей стерильности, а другой - Rf1 - должен быть введен из линии-восстановителя [5; 6].

О наличии генов Rf в генотипе можно судить по присутствию молекулярных маркеров, тесно сцепленных с ними. Было показано, что SCAR-маркер HRG02/OPY10, разработанный Р. Хорн с сотрудниками [5], может использоваться для поиска носителей гена Rf1 [4].

Производство  гибридных семян, проявляющих эффект гетерозиса в первом поколении, - основная методика повышения урожайности, валового сбора семян с высокими технологическими качествами. Для их промышленного производства используют материнские линии с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) и отцовские формы, несущие гены-восстановители фертильности пыльцы (Rf) [2].

Большинство созданных на основе системы ЦМС-Rf  гибридов подсолнечника имеют масличное направление, тогда как кондитерскому направлению уделялось недостаточное внимание. В настоящее время существует необходимость в создании гибридов кондитерского направления отечественной селекции, так как возрастает спрос на производство кондитерского сырья.

В коллекции генетических ресурсов подсолнечника ВИР, насчитывающей  2230 образцов культурного и 630 образцов дикорастущих видов, имеется 85 линий-восстановителей фертильности пыльцы масличного направления, однако они не могут быть использованы  при создании крупноплодного гибрида, так как не соответствуют необходимым критериям (недостаточный размер семянки, высокая масличность) [2].

На данный момент крупноплодные отцовские линии-восстановители пыльцы в коллекции отсутствуют. Цель данного исследования заключалась в исследовании сортов крупноплодного подсолнечника для поиска в них генов Rf1 при помощи SCAR-маркеров с дальнейшим созданием из них отцовских линий.

Материал и методы

Материалом  исследования служили 34 образца крупноплодного подсолнечника из коллекции ВИР, включающие 30 сортов отечественной и зарубежной селекции, одну линию (ВИР479), сорт Хейлудзянский, который был разделен на 3 фенотипически различные группы, и сорт Местный-9, который также был разделен на 2 формы - ветвистую и неветвистую. Весь материал репродуцирован в условиях Кубанской опытной станции ВИР. Геномную ДНК выделяли из этиолированных проростков с использованием модифицированного СТАБ-метода [1; 3]. В экстракционный буфер вводили поливинилпирролидон (PVP) 40000 и метабисульфит натрия; для удаления РНК полученные фракции ДНК инкубировали в течение 1 ч при 37 °С в присутствии РНКазы А. Для амплификации маркерного фрагмента HRG02 использовали праймер Y10 (прямой 5΄-AAA CGT GGG AGA GAG GTG G-3΄, обратный 5΄-AAA CGT GGG  CTG AAG AAC TA-3΄). ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация при 94 °С (45 сек), отжиг праймеров при 65 °С в течение 45 сек, элонгация при 72 °С (60 сек), количество циклов 35. Реакционная смесь (25 мкл) содержала 50 нг геномной ДНК, однократный реакционный буфер 10x (1,5 мM MgCl2), по 0,4 мкМ каждого из праймеров, по 0,2 мМ каждого dNTP и 0,2 ед. Taq-полимеразы. Электрофорез проводился в 1,8%-ном агарозном геле. В опытах проанализировали в среднем по 8 растений из каждого образца.

Результаты и обсуждение

На ДНК изученных генотипов праймеры Y10 инициировали синтез фрагмента HRG02 ожидаемого размера (740 п.н.) либо не давали продуктов амплификации. В основном сорта подсолнечника демонстрировали гетерогенность по наличию-отсутствию маркерных последовательностей HRG02, что можно объяснить неоднородностью геномов сортов по сравнению с инцухт-линиями, которые представляют собой не одно поколение инбридинга.

В результате исследованные образцы крупноплодного подсолнечника были условно размещены в 4 группы в зависимости от количества растений, в геноме которых был обнаружен маркер Y10 (таблица 1). Первая группа включает образцы с наличием маркера Y10 у более половины исследованных растений, вторая группа - наличие маркера у 20-50% растений, третья - у 10-20%, у четвертой группы маркер Y10 отсутствовал.

Таблица 1. Результаты скрининга образцов коллекции с использованием SCAR-маркера локуса Rf1

№ образца

Название образца

Кол-во выделенных проб (растений)

Присутствие маркера  Y10

Отсутствие маркера Y10

Наличие маркера Y10, %*

Группа 1: наличие маркера Y10 у >50% растений

1

к-2664, Приморский край

12

11

1

92

2

б/к, Северная Дакота, США

11

10

1

91

3

и-610067,с. 03002, Китай

11

10

1

91

4

к-3583, с. Местный-9, Аргентина (ветвистый)

9

8

1

89

5

к-3583, с. Местный-9, Аргентина (неветвистый)

8

7

0

88

6

к-2801, Приморский край

6

5

1

83

7

к-3578, с. Местный-2, Украина

9

7

1

78

8

и-610064, Хейлудзянский-1, Китай (ветвистый)

10

7

3

70

9

к-2676, Украина

6

4

2

67

Группа 2: наличие маркера Y10 у 20-50% растений

10

к-3510, Донской крупноплодный, Ростовская область

10

5

5

50

11

к-3581, Местный-5, Украина

10

5

5

50

12

к-2436, Кемеровская область

10

5

5

50

13

к-3573,с. Бородинский, Краснодар

2

1

1

50

14

к-2006, Приморский край

10

5

5

50

15

к-3426,с. СПК, Краснодар

10

5

5

50

16

и-610064, Хейлудзянский-1, Китай (неветвистый)

2

1

1

50

17

к-3526, с. Лакомка, Краснодар

12

4

8

33

18

к-1720, Киргизия

7

2

5

29

19

к-1898, Краснодарский край

9

2

7

22

20

VE-0100049 с. Mingren, США

10

2

8

20

21

б/к, ВИР479

10

2

8

20

Группа 3: наличие маркера Y10 у 10-20% растений

22

к-3150, Азербайджан

7

1

6

14

23

к-2642, с. Стадион, Болгария

8

1

7

13

24

к-2628, США

10

1

9

10

25

б/к с. Крупноплодный-2, Белгородская область

10

1

9

10

Группа 4: отсутствие маркера Y10 у растений

26

к-1964, с. Кубанский, Краснодарский край

5

0

5

0

27

к-3147, Азербайджан

8

0

7

0

28

и-610064, Хейлудзянский-1, Китай (неветвистый)

5

0

5

0

29

к-1589, Армения

5

0

5

0

30

к-2044, Франция

10

0

10

0

31

к-474, Армянская ССР

1

0

1

0

32

к-3516, Запорожский кондитерский

2

0

2

0

33

к-1833, Молдавия

10

0

10

0

34

к-2835, Приморский край

10

0

10

0

Примечание: * - количество растений, в геноме которых был обнаружен маркер Y10, выраженное в процентном соотношении от общего числа проанализированных растений данного сорта.

Из полученных данных можно сделать вывод о наличии у большинства исследованных сортов в геноме гена Rf1, так как лишь у 8 из 34 образцов маркер Y10 отсутствовал полностью. У 9 сортов: и-610064, Хейлудзянский-1, Китай; к-2676, Украина; и-610067, с. 03002, Китай; к-2801, Приморский край; б/к, Северная Дакота, США; к-3583, с. Местный-9, Аргентина (ветвистый); к-3583, с. Местный-9, Аргентина (неветвистый); к-3578, с. Местный-2, Украина; к-2664, Приморский край наличие маркера Y10 выявлено более чем у 60% проанализированных растений каждого образца. Причем необходимо отметить, что среди выявленных образцов присутствуют сорта как отечественной, так и зарубежной селекции.

Среди изученных образцов, в настоящий момент районированы кондитерские сорта подсолнечника - СПК, Лакомка, Донской крупноплодный, Бородинский. В сортах СПК, Донской крупноплодный и Бородинский в геноме половины исследованных растений каждого образца обнаружен маркер гена Rf1, в сорте Лакомка маркер Y10 присутствовал у 4 из 12 растений, это особенно важно, так как эти образцы имеют особенно ценные качества. Из данных сортов возможно создание отцовских линий-восстановителей фертильности пыльцы и в будущем гибрида кондитерского направления.

Для подтверждения достоверности данных молекулярно-генетического анализа необходимо провести гибридологический анализ в полевых условиях, причем образцы, показавшие полное отсутствие маркера Y10, в анализ не будут включены, что значительно сократит объем проводимых исследований. Также необходимо увеличить количество индивидуальных скрещиваний у сортов с незначительным процентным содержанием маркера гена Rf1 для повышения вероятности обнаружения растения, несущего интересуемый ген.

Таким образом, имеется потенциальная возможность создать отцовские линии-восстановители фертильности пыльцы кондитерского направления из образцов крупноплодного подсолнечника генетической коллекции ВИР им. Вавилова.

Работа частично поддержана РФФИ (проект № 12-04-00329).

Рецензенты:

Демурин Я.Н., д.б.н., профессор, заведующий лабораторией генетики ГНУ «ВНИИМК Россельхозакадемии», г. Краснодар.

Колясникова Н.Л., д.б.н., доцент, зав. кафедрой ботаники и генетики, физиологии растений и биотехнологий, ФГБОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова», г. Пермь.