Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ИЗУЧЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАТРИЧНО-АКТИВИРОВАННОЙ ЛАЗЕРНОЙ ДЕСОРБЦИОННОЙ ИОНИЗАЦИИ

Новиков О.О. 1 Писарев Д.И. 1 Журавель М.А. 1
1 ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», Белгород
В статье изложены данные о химическом изучении цветков клевера лугового с использованием метода марично-активированной лазерной десорбционной ионизации. Метод MALDI нас привлёк по причине того, что позволяет анализировать смеси веществ без их предварительного разделения. Применение метода матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) позволило предварительно охарактеризовать состав смесей флавоноидов в цветках клевера лугового без предварительного их разделения на отдельные компоненты. Выделение суммы флавоноидов осуществляли с помощью препаративной тонкослойной хроматографии. В выделенных элюатах методом УФ-спектроскопии в сочетании с шифт-реактивами обнаружены флавониды. Дальнейшую идентификацию проводили с помощью метода MALDI. Использованием данного метода в сочетании с тонкослойной хроматографией и УФ-спектрофотометрией удалось идентифицировать в цветках клевера лугового кемпферол-3-глюкозида, гликозидов кверцетина и изорамнетина, изофлавоноидов - генистеина, биоханина, формононетина. Наличие флавоноидов и изофлавоноидов в цветках клевера лугового открывает широкую перспективу для получения лекарственных препаратов гипохолестеринемического и эстрогенного действия.
цветки клевера лугового
флавоноиды
изофлавоноиды
масс-спектрометрия
УФ-спектросокпия
лютеолин-7-гликозид
генистеин
биоханин
формононетин
1. Государственная фармакопея Союза Советских Социалистических Республик / редкол.: Ю.Г. Бобков и др. XI изд. – М. : Медицина, 1987. – Вып. I: Общие методы анализа. – 334 с.
2. Дикорастущие полезные растения России : [справ.] / Ботан. ин-т им. В.Л. Комарова, РАН, С.-Петерб. гос. хим.-фармац. акад. ; отв. ред.: А.Л. Буданцев, Е.Е. Лесиовская. – СПб. : Изд-во СПХФА, 2001. – 662 с.
3. Органическая химия : учебник для студентов высш. учеб. заведений по спец. «Фармация»: в 2 кн. / под ред. Н.А. Тюкавиной. – М. : Дрофа, 2008. – Кн. 2: Спец. курс. – 591 с. (Высш. образование: соврем. учебник).
4. Отто М. Современные методы аналитической химии. – М. : Техносфера, 2006. – 543 с. (Мир химии).
5. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения : учеб. пособие / под ред. Г.П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. – СПб. : СпецЛит: Изд-во СПХФА, 2002. – 405 с.
Введение. В настоящее время интерес, проявляемый к изучению флавоноидов специалистами разных направлений, существенно возрос. Причина этого заключается в их значительной биологической роли в живых системах и разнонаправленном фармакологическом действии. Для флавоноидов достоверно установлены такие фармакологические эффекты, как иммуностимулирующий, противоопухолевый, кардио-, гепато- и геропротекторный, антитромбоцитный, противоаллергический, противовирусный, гипохолестеринемический, капилляроукрепляющий, эстрогенный [5].

Доминирующее действие флавоноидов - антирадикальное, связанное с наличием в их структуре фенольных гидроксилов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях радикального типа. В этих реакциях флавоноиды выступают в роли восстановителей - доноров электронов по отношению к какому-либо радикальному агенту, переходя в свою окисленную форму - флавоксильный радикал [3].

Для анализа флавоноидов в объектах растительного происхождения применяют разнообразные инструментальные методы, в особенности хроматографические. В меньшей степени используется масс-спектрометрия, а именно матрично-активированная лазерная десорбционная ионизация (MALDI), метод, использующийся в основном для анализа высокомолекулярных соединений [1; 3; 4].

Метод MALDI нас привлёк по причине того, что позволяет анализировать смеси веществ без их предварительного разделения.

В связи с этим нами поставлена цель настоящего исследования - установление возможности применения метода матрично-активированного лазерной десорбционной ионизации (MALDI) для определения флавоноидного состава цветков клевера лугового.

В качестве объекта исследования был взят образец цветков клевера лугового, являющегося представителем местной флоры, широко распространенным, легко культивируемым в качестве кормового [2].

Для реализации поставленной цели основной задачей исследования явилось изучение флавоноидного состава выбранного объекта.

Для выделения флавоноидов нами использована схема, согласно которой сырьё - цветки клевера экстрагировали пятикратно 96%-ным спиртом этиловым в аппарате Сокслета.

Полученную сумму сгущали на ротационном вакуум-испарителе ИР-1. Остаток разбавляли водой и отстаивали в холодильнике в течение суток. Выпавший осадок липофильных веществ отделяли под вакуумом, и фильтрат оставляли в холодильнике для просветления. Отстоявшуюся жидкость фракционировали хлороформом и этилацетатом.

Полученные фракции упаривали под вакуумом, таким образом, получены хлороформная фракция Х-1 и этилацетатная - Э-1.

Фракцию Э-1 переосаждали хлороформом и отстаивали в холодильнике. Выпавший жёлтый кристаллический осадок отделяли центрифугированием.

Осадок очищали методом препаративной тонкослойной хроматографии в тонком слое силикагеля на пластинках Silufol. Элюирование осуществляли в системе «этилацетат - уксусная кислота - муравьиная кислота - вода» в соотношениях (10:1:1:2,6). В результате в центральной части хроматограммы наблюдалась широкая полоса ярко-жёлтого цвета (Ф-1) соответствующая гликозиду, в верхней части хроматограммы локализовалась узкая полоса тёмного цвета (Ф-2) агликона. Слой силикагеля у полученной полосы снимали с хроматограммы и элюировали спиртом этиловым 96%-ным.

Элюат спектрофотометрировали на УФ-спектрофотометре СФ-56. УФ-спектр вещества Ф-1 в области 220-400 нм имел максимум поглощения 264 и 355 нм и два плеча 303 и 305 нм, что характерно для флавонолов.

Для установления расположения гидроксильных групп в структуре соединения использовали шифт-реактивы. При использовании шифт-пробы с алюминия хлоридом наблюдался батохромный сдвиг обеих полос поглощения - первой с 355 до 398 нм, второй с 264 до 273 нм, что свидетельствует о свободной гидроксильной группе в 5 положении.

Добавление нескольких капель соляной кислоты не привело к гипсохромному сдвигу, что говорит об отсутствии о-дигидроксигруппировки в кольце В. При добавлении ацетата натрия наблюдалась батохромия первой полосы поглощения, что свидетельствует о свободной гидроксильной группе в положении 7.

Регистрацию масс-спектров проводили на приборе масс-спектрометр «Autoflex II» «MALDI TOF/TOF» фирмы Bruker Daltonics производства Германии. Предварительно анализируемые пробы в количестве по 0,5 μl с помощью дозатора наносили на мишень «MTP 384 target plate matt steel TF», высушивали и сверху наносили каплю матрицы. В качестве матрицы использовали α-цианокоричную кислоту, регистрацию спектров вели с помощью программы Flex Control, обработку данных осуществляли в программе Flex Analis, в отражённом режиме при положительной полярности (reflective positive).

В масс-спектре изучаемого вещества наблюдался наиболее интенсивный пик иона m/z = 287,259 - соответствующий кемпферолу, и менее выраженный пик иона m/z = 471,117 - отвечающий гликозидной структуре (рис. 1).

Рис. 1. Масс-спектр вещества Ф-1 из цветков клевера лугового.

Приведённые выше данные позволили охарактеризовать вещество как кемпферол-3-глюкозид или трифолин.

Маточник после отделения осадка исследовали на наличие других флавоноидов методом масс-спектрометрии. Присутствие характеристических пиков молекулярных ионов с m/z = 303,312 и 487,247 соответствует моногликозиду кверцетина в натриевой форме, а m/z =317,301 и 501,255 моногликозиду изорамнетина (рис. 2).

Рис. 2. Масс-спектр этилацетатной фракции цветков клевера лугового.

В хлороформной фракции обнаружены агликоны изофлавоноидов. Её предварительно упаривали досуха, растворяли в спирте этиловом и регистрировали УФ-спектры. В УФ-спектре в диапазоне 220-400 нм наблюдался один максимум поглощения при λ = 262 нм, что характерно для изофлавоноидов группы генистеина (рис. 3).

Рис. 3. УФ-спектр хлороформной фракции цветков клевера лугового.

 

При масс-спектрометрическом исследовании полученной фракции наблюдалось присутствие трёх интенсивных пиков ионов m/z = 269,357; 285,348 и 272,407 - соответствующих агликонам: формононетину, биоханину и генистеину (рис. 4).

 

Рис. 4. Масс-спектр хлороформной фракции цветков клевера лугового.

Таким образом, в ходе настоящего исследования установлено, что использование метода матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) позволило предварительно охарактеризовать состав смесей флавоноидов в цветках клевера лугового без предварительного их разделения на отдельные компоненты.

Рецензенты

  • Дроздова И.Л., д.ф.н., профессор кафедры фармакогнозии и ботаники, декан фармацевтического факультета Курского государственного университета, г. Курск.
  • Бубенчикова В.Н., д.ф.н., профессор, заведующая кафедрой фармакогнозии и ботаники Курского государственного медицинского университета, г. Курск.

Библиографическая ссылка

Новиков О.О., Писарев Д.И., Журавель М.А. ИЗУЧЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАТРИЧНО-АКТИВИРОВАННОЙ ЛАЗЕРНОЙ ДЕСОРБЦИОННОЙ ИОНИЗАЦИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 4. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=6653 (дата обращения: 25.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074