Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Егорова Н.О. 1 Мальцева Е.М. 2 Егорова И.Н. 1 Егорова О.Н. 3 Серикова Н.Б. 3

---

1 Институт экологии человека ФИЦ УУХ СО РАН

2 ФГБОУ «Кемеровский государственный медицинский университет» Минздрава РФ

3 ГАУЗ КО «ОКБСМП им. М.А. Подгорбунского»

В статье изложены результаты исследований по оценке антимикробной и антирадикальной активности сухих экстрактов травы Sanguisorba officinalis L., полученных различными методами экстракции. Антимикробную активность оценивали с помощью метода диффузии в агар. В качестве тестовых культур были использованы грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы, взятые из музея живых культур бактериологической лаборатории и из различных биологических локусов пациентов отделения реанимации ГАУЗ КО «ОКБСМП им. М.А. Подгорбунского» города Кемерово: Staphylococcus aureus (MRSA), Klebsiel apneumonia (BLRS), Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Proteus vulgaris, дрожжеподобные грибы – Candida albicans. Корреляция между антирадикальной активностью и составом полифенольного комплекса травы кровохлебки показала, что основными соединениями, определяющими активность, являются дубильные вещества гидролизуемого типа. Все анализируемые извлечения активны в отношении Staphylococcus aureus и Candida albicans. Наибольшее угнетение роста штаммов Klebsiela pneumonia (BLRS) и Enterococcus faecium показали извлечения, полученные методом циркуляционной экстракции. В отношении Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris антимикробная активность отсутствовала. Было выявлено, что наиболее широким спектром антибактериальной активности и высокой антирадикальной активностью обладает экстракт травы кровохлебки, полученный методом циркуляционной экстракции 70% этанолом.

Статья в формате PDF

186 KB

антирадикальная активность.

антимикробная активность

Sanguisorba officinalis L.

1. Cioch M., Satora P., Skotniczny M. et al. Characterisation of Antimicrobial Properties of Extracts of Selected Medicinal Plants // Polish Journal of Microbiology, 2017, vol. 66, no. 4, pp. 463-472.

2. Cowan M.M. Plant Products as Antimicrobial Agents // Clinical Microbiology reviews, 1999, vol. 12, no. 4, pp. 564-582.

3. Дикорастущие полезные растения России / отв. ред. А.Л. Буданцев, Е.Е. Лесиовская. – СПб.: Изд-во СПХФА, 2001. - С. 497-498.

4. Gawron-Gzella А., Witkowska-Banaszczak E., Bylka W. et al. Chemical Composition, Antioxidant and Antimicrobial Activities of Sanguisorba officinalis L. // Extracts. Pharmaceutical Chemistry Journal, 2016, vol. 50, no. 4, рр. 244-249.

5. Растительные ресурсы России: дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность / отв. ред. А.Л. Буданцев. – СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2009. – Т. 2. - С. 239-240.

6. Антиоксидантная и антирадикальная активность in vitro экстрактов травы Sanguisorba officinalis L., собранной в различные фазы развития / Е.М. Мальцева [и др.] // Медицина в Кузбассе. – 2017. - Т. 16. - № 2. – С. 32-38.

7. Ginovyan M.M. Effect of heat treatment on antimicrobial activity of crude extracts of some Armenian herbs. Proceedings of the Yerevan state university // Chemistry and Biology, 2017, vol. 51, no 2, pp. 113–117.

8. Ginovyan M., Petrosyan M., Trchounian A. Antimicrobial activity of some plant materials used in Armenian traditionalmedicine // BMC Complementary and Alternative Medicine, 2017, 17:50. https://doi.org/10.1186/s12906-017-1573-y.

9. Janovskẚ D., Kubikova K., Kokoska L. Screening for antimicrobial activity of some medicinal plants species of traditional Chinese medicine // Czech J. Food Sci., 2003, vol. 21, no 3, pp. 107–110.

10. Cheng-Hong Yang, Hsueh-Wei Chang, Ho-Yang Lin, Li-Yeh Chuang. Evaluation of Antioxidant and Antimicrobial Activities from 28 Chinese Herbal Medicines // Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2013, vol. 2, no. 1, рр. 294-305.

11. Егорова Н.О. Содержание полифенолов в надземной части кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) // Молодая фармация – потенциал будущего: тезисы докл. Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием (Санкт-Петербург, 20-21 апреля 2011 г.). – СПб., 2011. – С. 42-44.

12. Мальцева Е.М., Егорова Н.О., Егорова И.Н. Количественное определение суммарного содержания флавоноидов в траве кровохлебки лекарственной // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2011. - № 3/1. - С. 68.

В связи с формированием штаммов микроорганизмов с множественной антибиотикорезистентностью все больший интерес вызывают новые лекарственные средства на основе растительных биологически активных соединений (БАС), обладающих антимикробным действием. Согласно литературным данным, среди БАС, сочетающих низкую токсичность со способностью эффективно действовать на патогенную и условно патогенную микрофлору, ведущую роль играют полифенольные соединения (дубильные вещества, проантоцианидины, катехины, флавоноиды) [1; 2].

Кровохлебка лекарственная  (Sanguisorba officinalis L.) сем. Розовых – Rosaceae, широко известное многолетнее растение, подземные органы которого применяются в официальной и традиционной медицине народов в России, в странах Европы, Северной Африки, Северной Америки, Китае и Азии. Водные и спиртовые извлечения используется внутрь для лечения кишечных инфекций и язвы двенадцатиперстной кишки, при геморрое, меноррагиях и наружно для лечения ран, язв и ожогов, гингивитах, стоматитах, для остановки кровотечений [3; 4].

Многочисленные исследования показывают, что подземная и надземная части кровохлебки лекарственной обладают выраженной фармакологической активностью, которая связана с наличием дубильных веществ, эллаготанинов, проантоцианидинов, катехинов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, тритерпеновых гликозидов, производных олеаноловой и урсоловой кислот и полисахаридов [5]. Полифенольный комплекс травы обладает антиоксидантной и антирадикальной активностью [6].

Анализ зарубежной литературы свидетельствует о выраженных антимикробных свойствах кровохлебки лекарственной, произрастающей в Болгарии. Армении, Китае [4; 7-10]. Обнаружено, что водные, метанольные извлечения из подземной и надземной части растения активны в отношении грамположительных (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis) и грамотрицательных (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiela pneumonia, Escherichia coli) микроорганизмов в МИК = 0,07-2,5 мг/мл [4]. Другие исследования [7] показывают отсутствие активности метанольных и ацетоновых извлечений травы кровохлебки в отношении ампициллин- и канамицин-резистентного штамма Escherichia coli и высокую активность в отношении штаммов Escherichia coli М-17 и Staphylococcus aureus MDS 5233 в концентрации 500 мкг/мл.

В работе [8] показано, что водные, метанольные, хлороформные, ацетоновые и гексановые извлечения из надземной части кровохлебки угнетают рост Pseudomonas aeruginosa GRP3 (VKPHB-82-5), Staphylococcus aureus WDCM 5233, Bacillus subtilis WT-A1 и дрожжеподобные грибы Candida albicans 174, Candida quilliermondii HP-17. Этанольные извлечения из корневища и травы растения показали наивысшую активность в отношении Bacillus cereus в МИК 15,63 и 62,50 мг/мл соответственно [9]. Описан ингибирующий эффект 95% этанольного экстракта подземной части кровохлебки лекарственной на рост Acinetobacter baumannii ATCC 19606 [10].

Таким образом, перспективность изучения антимикробной активности извлечений травы кровохлебки лекарственной в целях дальнейшего расширения возможностей ее применения в медицинской практике не вызывает сомнения.

Цель работы - скрининговое изучение состава полифенольного комплекса, антимикробной и антирадикальной активности in vitro спиртовых извлечений травы кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.), полученных различными методами экстракции.

Материал и методы. Траву кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) собирали во время цветения в июле-августе 2016 года в Топкинском районе Кемеровской области. Сырье сушили до воздушно-сухого состояния, измельчали до размера частиц 2 мм, упаковывали в пакеты из крафт-бумаги и хранили в сухом прохладном месте.

Для получения сухих экстрактов использовали метод мацерации и варианты циркуляционной экстракции. В первом случае сырье экстрагировали 70% спиртом этиловым в соотношении 1:10 в течение 10 дней (КР-I). Во втором случае сырье помещали в аппарат Сокслета, неполярные соединения экстрагировали хлороформом, затем экстракцию проводили 70% спиртом этиловым (КР-II). В третьем – сырье экстрагировали 70% этанолом в аппарате Сокслета (КР-III). Полученные извлечения концентрировали и сушили в сушильном шкафу при температуре не выше 50 °С до сухого остатка (влажность не более 5%).

Количественное содержание суммы полифенолов в исследуемых экстрактах определяли спектрофотометрическим методом с реактивом Folin-Ciocalteu [6; 11] в пересчете на танин. Содержание флавоноидов (ФВ) в исследуемых экстрактах определяли спектрофотометрическим методом, по реакции образования окрашенных комплексов с 5% спиртовым раствором алюминия хлорида [12]. Содержание суммы проантоцианидинов (ПАЦ) в исследуемых извлечениях проводили модифицированным методом Porter [6] в пересчете на цианидина хлорид.

Антирадикальную активность определяли методом, основанным на взаимодействии антиоксидантов со стабильным хромоген-радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (DPPH) [6]. Для каждого исследуемого экстракта был построен график зависимости антирадикальной активности от концентрации (мкг/мл) и проведен корреляционно-регрессионный анализ. Результат выражен величиной I_C50, это концентрация экстрактов, приводящая к ингибированию 50% радикалов DPPH. Спектрофотометрические исследования проводили на фотометре КФК-3 (Россия) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Все измерения выполнены в трехкратной повторности. Статистическую обработку результатов измерения проводили согласно требованиям ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов эксперимента». Корреляционно-регрессионный анализ выполнен с применением стандартной программы Microsoft Office Excel 2010.

Антимикробную активность полученных извлечений изучали методом диффузии в агар. Навески полученных сухих экстрактов растворяли в 30% этаноле. Для каждого образца готовили три разбавления с концентрацией 1,0; 0,5 и 0,1%. В качестве тест-микроорганизмов использовали наиболее распространенные возбудители гнойно-воспалительных заболеваний, относящихся к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Staphylococcus aureus, Klebsiela pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Proteus vulgaris и дрожжеподобные грибы – Candida albicans. Тестовые микроорганизмы взяты из музея живых культур бактериологической лаборатории ГАУЗ КО «ОКБСМП им. М.А. Подгорбунского» г. Кемерово и из различных биологических локусов пациентов отделения реанимации того же лечебного учреждения.

Посев микроорганизмов был проведен в чашках Петри на 20 мл среды Мюллера-Хитонас добавлением 2 мл исследуемых растворов. В качестве положительного контроля были использованы коммерческие антибиотики широкого спектра действия: ампициллина тригидрат (50 мг/мл), гентамицина сульфат (2 мг/мл), доксициклин (10 мг/мл), антибактериальный сульфаниламидный препарат – сульфадимезин (25 мг/мл) и противомикробный препарат нитрофуранового ряда - энтерофурил (10 мг/мл). Опытные и контрольные посевы инкубировали при температуре 37 ºС в течение 24 часов и визуально оценивали интенсивность роста микроорганизмов.

Результаты и обсуждение. Выделение суммы полифенолов из травы кровохлебки лекарственной проводилось 70% этанолом, так как именно этот экстрагент обеспечивает наиболее высокий выход экстрактивных соединений фенольного характера из сырья [11]. В настоящей работе экстракцию проводили различными методами: мацерации (КР-I), циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета с предварительным отделением липофильной фракции из сырья хлороформом (КР-II) и циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета (КР-III). В полученных экстрактах определено суммарное содержание полифенольных соединений в пересчете на танин, флавоноидов в пересчете на рутин и ПАЦ в пересчете на цианидина хлорид. Результаты определения представлены в таблице 1.

Из полученных данных видно, что КР-III содержит на 30,65% больше полифенолов, чем КР-I, и на 9,2% - чем КР-II. Максимальное содержание флавоноидов обнаружено в КР-II – 4,98±0,06%, что на 18% ниже, чем в КР-I, и 32,7% - чем в КР-III. Выбор способа экстракции практически не оказывает влияние на содержание ПАЦ. Результаты исследования показывают, что максимальное количество дубильных веществ (ДВ) гидролизуемого типа (ДВ = ПФС – ФВ – ПАЦ) содержится в КР-III - 82,90±0,92%, в КР-I и КР-II содержание этой группы БАС составляет 74,02±0,08% и 75,02±0,54% соответственно. Таким образом, способ экстракции влияет на содержание общей суммы полифенолов и в меньшей степени - на количество экстрагируемых отдельных групп фенольных соединений.

Таблица 1

Содержание компонентов полифенольного комплекса в сухих экстрактах

травы Sanguisorba officinalis L. и их антирадикальная активность

*Достоверность р< 0,05.

Антирадикальная активность изучаемых экстрактов, выраженная как способность ингибировать 50% свободных радикалов DPPH, представлена в таблице 1. Большую активность проявил экстракт КР-III (I_{C50 =} 28,57 мкг/мл). Антирадикальная активность КР-III выше в 2,80 и 1,79 раза, чем у экстрактов КР-I и КР-II соответственно. Однако в сравнении со стандартным антиоксидантом танином, представляющим смесь ДВ гидролизуемого типа, антирадикальная активность КР-III была меньше в 4,76 раза. Таким образом, наблюдается положительная корреляция между антирадикальной активностью и содержанием ДВ гидролизуемого типа в исследуемых экстрактах.

Антимикробную активность изучали на двух музейных штаммах грамположительных (Staphylococcus aureus (MRSA), Enterococcus faecium) и трех штаммах грамотрицательных бактерий (Klebsiela pneumonia (BLRS), Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris) и дрожжеподобных грибах – Candida albicans. Все изученные экстракты в исследуемых концентрациях показали выраженную антимикробную активность в отношении всех бактерий. Результаты изучения влияния различных разведений изучаемых экстрактов на рост микроорганизмов, выделенных из различных биологических локусов пациентов отделения реанимации, представлены в таблице 2.

Полученные данные показывают, что экстракты травы кровохлебки проявили умеренную антимикробную активность в отношении следующих штаммов микроорганизмов: St. аureus (MRSA), K. рneumonia (BLRS), P. aeruginosa, E. faecium и дрожжеподобных грибов – C. albicans. В отношении P. aeruginosa и Pr. vulgaris антимикробная активность отсутствует.

Таблица 2

Влияние экстрактов травы Sanguisorba officinalis L. на рост штаммов микроорганизмов, выделенных из биологических локусов пациентов отделения реанимации

Примечания: «±» – слабый рост бактерий; «+» – сплошной рост бактерий в присутствии препарата. BLRS - бета-лактамаза расширенного действия; MRSA - метициллинрезистентные стафилококки.

Приведенные в таблице 2 данные свидетельствует о том, что все изучаемые экстракты в концентрации 20 и 10 мг/мл независимо от способа получения проявили антимикробную активность по отношению к грамположительным бактериям St. аureus. Антимикробная активность изученных экстрактов сопоставима с активностью гентамицина сульфата в концентрации 2 мг/мл, при этом ампициллин (50 мг/мл), сульфадимезин (25 мг/мл) и энтерофурил (10 мг/мл) не влияют на рост данного микроорганизма (табл. 3). В отношении K. pneumoniae BLRS умеренное подавление роста отмечалось у экстрактов КР-II и КР-III в концентрации 20 и 10 мг/мл, что сопоставимо с действием энторофурила в концентрации 10 мг/мл (табл. 3). КР-I во всех разведениях не оказывает влияния на рост K. pneumoniae BLRS.

Таблица 3

Влияние препаратов контроля на рост штаммов микроорганизмов, выделенных из биологических локусов пациентов отделения реанимации

Примечания: «-» - отсутствие роста бактерий, «±» – слабый рост бактерий; «+» – сплошной рост бактерий. BLRS - бета-лактамаза расширенного действия; MRSA - метициллинрезистентные стафилококки.

Наиболее выраженную антимикробную активность в отношении E. faecium проявляет экстракт КР-III в концентрации 2, 10 и 20 мг/мл. Подавление роста E. faecium КР-IIIсходно с действием ампициллина (50 мг/мл), сульфадимезина (25 мг/мл) и энтерофурила (10 мг/мл).

Вывод

Проведенное исследование указывает на связь между антирадикальной активностью и составом полифенольного комплекса экстрактов травы кровохлебки, полученных разными способами. Представленные результаты показали, что все исследуемые экстракты в концентрации 20 и 10 мг/мл умеренно задерживают рост Staphylococcus aureus и Candida albicans. Наибольшее угнетение роста штаммов Klebsiela pneumonia (BLRS) и Enterococcus faecium продемонстрировали экстракты из травы кровохлебки, полученные методом циркуляционной экстракции (КР-III). В отношении Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris антимикробная активность отсутствует.

Таким образом, наибольшее влияние на угнетение роста изученных штаммов микроорганизмов и проявление антирадикальной активности показывает экстракт травы кровохлебки, полученный методом циркуляционной экстракции 70% этанолом.

Библиографическая ссылка