Проведен анализ регуляции термоинактивации нового психрофильного фермента, обнаруженного авторами на предыдущих этапах исследования – олигопептидазы В из Serratia рroteamaculans (PSP). Исследовано влияние температуры и состава реакционной среды, а также комплексообразования с шаперонином GroEL Escherichia coli на скорость инактивации фермента. Проведено сравнение скоростей инактивации PSP и мезофильного фермента – трипсина – при 37-50 °С. Продемонстрирован психрофильный характер PSP: этот фермент достаточно быстро утрачивал активность в 0,1 М Tris-НСl-буфере pH 8,0 уже при 37 °C в отличие от сравнительно устойчивого в этих условиях трипсина. Обнаружен эффект термостабилизации PSP глицерином при 37-50 °С. Выявлено, что ионы кальция и буферные растворы низкой молярности вызывают противоположный эффект – ускоряют инактивацию PSP при повышенных температурах. Проведена искусственная реконструкция природного комплекса PSP с шаперонином из S. рroteamaculans, обнаруженного ранее при выделении PSP: получен прочный комплекс (1:1) шаперонина GroEL E. сoli с активным рекомбинантным ферментом PSP. Обнаружено, что комплексообразование с шаперонином повышает термостабильность PSP.
Analysis of the regulation of the thermoinactivation of new psychrophilic enzyme – oligopeptidase B from Serratia рroteamaculans (PSP) was carried out. The influence of temperature and composition of the reaction medium, as well as the complex formation with shaperonin GroEL from Escherichia coli on the rate of the enzyme inactivation was studied. The comparison of inactivation rates of PSP and mesophilic enzyme trypsin at 37-50°С was carried out. The psychrophilic character of PSP was demonstrated: this enzyme lost its activity rapidly in 0,1 М Tris-НСl-buffer pH 8,0 already at 37°C in contrast to comparatively stable trypsin. The effect of PSP thermostabilisation by glycerin at 37-50°С was revealed. Calcium ions and buffer solution of low molarity cause the opposite effect – the acceleration of PSP inactivation at increased temperatures. The artificial reconstruction of the natural complex PSP-shaperonin from S. рroteamaculans was carried on: the stable complex (1:1) of shaperonin GroEL E. сoli with active recombinant enzyme PSP was obtained. It was shown that complex formation with shaperonin promote PSP thermostability.
1. Михайлова А.Г. Новая психрофильная трипсиноподобная протеиназа из Serratia proteamaculans // Биохимия. – 2006. – Т. 71. – С. 697-706.
2. Михайлова А.Г. Олигопептидаза В из Serratia proteamaculans. II. Энзиматическая характеристика – субстратный анализ, влияние ионов кальция, pН- и температурная зависимость // Биохимия. – 2011. – Т. 76. – C. 591–603.
3. Михайлова А.Г. Олигопептидаза В из Serratia proteamaculans. III. Ингибиторный анализ. Особенности взаимодействия с ингибиторами металлопротеиназ // Биохимия. – 2012. – Т. 77. – C. 384–391.
4. Хайруллин Р.Ф. Олигопептидаза В из Serratia proteamaculans. I. Определение первичной структуры, выделение и очистка природного и рекомбинантного фермента // Биохимия. – 2009. – Т. 74. – C. 1427-1437.
5. Coetzer T.H., Goldring J.P., Huson L.E. Oligopeptidase B: a processing peptidase involved in pathogenesis // Biochimie. – 2008. – Vol. 90. – P. 336-344.
6. Da Silva-Lopez R.E., Morgado-Diaz J.A., Dos Santos P.T., Giovanni-De-Simone S. Purification and subcellular localization of a secreted 75 kDa Trypanosoma cruzi serine oligopeptidase // Acta Trop. – 2008. – Vol. 107. – P. 159-167.
7. Feller G., Gerday C. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation // Nat.Rev.Microbiol. – 2003. – Vol. 1. – P. 200-208.
8. Morty R.E., Fulop V., Andrews N.W. Substrate recognition properties of oligopeptidase B from Salmonella enterica serovar Typhimurium // J.Bacteriol. – 2002. – V. Vol. 184. – P. 3329-3337.
9. Naletova I.N., Muronetz V.I., Schmalhausen E.V. Unfolded, oxidized, and thermoinactivated forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interact with the chaperonin GroEL in different ways // Biochim.Biophys.Acta. – 2006. – Vol. 1764. – P. 831-838.
10. Yan J.B. High-level expression and purification of Escherichia coli oligopeptidase B // Protein Expr.Purif. – 2006. – Vol. 47. – P. 645-650.